PRRS病毒主要受体蛋白CD151和CD163真核表达载体的构建

阮征李杰刘开武王莲芳华娟胡小明刘杰，黄海军，4

（1. 武汉市畜牧兽医科学研究所，武汉 430208；2. 武汉市重大动物疫病防控中心，武汉 430023；3.华中农业大学 猪遗传育种农业部重点实验室&农业动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室，武汉 430070；4. 武汉市畜牧兽医局，武汉 430023）

PRRS病毒主要受体蛋白CD151和CD163真核表达载体的构建

阮征1，2李杰1刘开武2王莲芳1华娟1胡小明3刘杰1，3黄海军1，4

（1. 武汉市畜牧兽医科学研究所，武汉 430208；2. 武汉市重大动物疫病防控中心，武汉 430023；3.华中农业大学 猪遗传育种农业部重点实验室&农业动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室，武汉 430070；4. 武汉市畜牧兽医局，武汉 430023）

为了进一步研究PRRSV 与细胞受体之间的相互作用机理，通过基因工程方法从PAM 细胞中克隆获得了CD151和CD163 全长编码片段，利用Sal I和Kpn I内切酶对回收得到的CD151（762 bp）和CD163（3 333 bp）DNA片段进行酶切，构建了pIRES2-EGFP-CD151和pIRES2-EGFP-CD163真核表达载体。经PCR 和酶切鉴定后，分别提取重组质粒进行细胞转染。荧光显微镜下可见单独转染CD151和CD163基因或CD151/CD163共转染的Marc 145细胞表达强烈的绿色荧光，Western blot分析结果进一步证实，CD151和CD163蛋白在转染后的细胞中获得超表达。猪CD151和CD163 真核表达载体的成功构建为进一步探索CD151和CD163在PRRSV 感染细胞过程中的协同作用提供了物质基础，特别是对深入研究PRRS病毒的入侵及宿主识别具有重要意义。

猪繁殖与呼吸综合征病毒 CD151分子 CD163分子 真核表达载体 细胞转染

猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是猪群中流行的重要传染病之一，病原为猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV），

可引起母猪的繁殖障碍（包括流产、早产、死胎、木乃伊胎等）、仔猪成活率急剧下降和育成猪呼吸道疾病［1-3］。PRRSV有严格的宿主和细胞嗜性，需要首先与细胞受体结合，通过内吞作用进人细胞内，在胞内完成病毒的脱壳与基因组释放［4-6］。

目前发现的PRRSV感染相关受体有唾液酸黏附素、硫酸乙酰肝素、CD163分子、CD151分子和波形蛋白［8-11］。有关研究结果表明PAM细胞表面存在唾液酸黏附素和硫酸乙酰肝素两种PRRSV相关受体，在PRRSV感染巨噬细胞过程中主要起帮助黏附、内化的作用［7］；而在Marc-145细胞中波形蛋白起到PRRSV受体作用；CD151能与PRRSV 3'端非转录区（3'URT）发生结合，进而导致PRRSV与细胞发生相互作用进入细胞内产生感染。通过转染使PRRSV非敏感细胞BHK-21表达CD151会使该细胞允许PRRSV的感染，增殖程度高达100倍［8］。CD163为一种SRCR超家族的Hapten Hemoglobin清道夫受体，是130 000的细胞表面糖蛋白，在PRRSV感染巨噬细胞过程中介导病毒在细胞质中的脱衣壳和病毒基因组的释放［9-11］。

本研究通过构建猪CD151和CD163 真核表达载体，为进一步探索CD151和CD163在PRRSV 感染细胞过程中的协同作用提供了物质基础，特别是对深入研究PRRS病毒的入侵及宿主识别具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料

大肠杆菌DH5α由华中农业大学猪遗传育种与繁殖农业部重点实验室提供。猪肺泡巨噬细胞（PAM）由华中农业大学动物科技学院胡小明博士惠赠。

限制性内切酶EcoR I、BamH I、T4 DNA连接酶、Taq DNA聚合酶、DNA marker、DNA Gel Extraction Kit、Plasmid mini preps Kit均购自华美生物工程公司。脂质体2000购自Invitrogen公司。pMD18-T购自TaKaRa公司。载体pIRES2-EGFP购自BD Biosciences Clontech公司。

1.2 方法

1.2.1 引物设计与合成 根据GenBank报道的猪CD151（NM_001243865.1）和CD163（NM_213976.1）基因序列，以此为模板，利用primer premier 6及Oligo 6软件进行引物设计（表1）。引物由上海生物工程公司合成。

表1 猪CD151和CD163基因cDNA扩增的引物序列

1.2.2 目的基因的PCR扩增 利用提取的猪PAM细胞总RNA反转录为cDNA为模板，表1中的CDS全长引物进行PCR扩增。采用KOD DNA聚合酶，PCR反应体系为50 μL体系，其中包括ddH2O 10 μL，dNTPs 8 μL（浓度为10 mmol/L），2×Buffer 25 μL，cDNA模板4 μL，上下游引物分别添加1 μL KOD DNA聚合酶1 μL。PCR反应程序：94℃预变性2 min；98℃变性10 s，退火30 s，68℃延伸 40 s，35个循环。PCR反应结束后，取10 μL PCR 扩增产物进行电泳，利用G-BOX凝胶成像系统观察结果。

1.2.3 目的片段的回收、酶切和纯化 按照DNA胶回收试剂盒（Axygen，USA）说明书操作程序回收目的DNA。利用Sal I和Kpn I内切酶对回收得到的CD151（762 bp） 和CD163（3 333 bp）DNA片段进行双酶切（20 μL体系）：1.5T 3 μL，BSA 2 μL，DNA 14 μL，Sal I 0.5 μL，Kpn I 0.5 μL。在37℃恒温箱中酶切5 h之后，再用DNA回收试剂盒进行纯化，纯化得到的产物可用于下一步的连接。

1.2.4 载体酶切、回收和连接 利用Sal I和Kpn I内切酶对空载体pIRES2-EGFP进行双酶切，酶切体系（20 μL）如下：体系：ddH2O 10 μL，1.5T 3 μL，BSA 2 μL，DNA 4 μL（2 μg），Sal I 0.5 μL，Kpn I 0.5 μL。酶切之后，利用胶回收试剂盒对目的片段进行回收。最后将得到的线性载体与目的基因DNA进行连接（20 μL）：ddH2O 9 μL，buffer 2 μL，DNA 6 μL（0.3 pmol），Vector 2 μL（0.03 pmol），T4 ligase 1 μL。在4℃连接反应过夜。

1.2.5 连接产物转化DH5α 无菌条件下，在100 μL的感受态细胞中加入10 μL连接产物，混匀后冰

浴30 min。然后42℃水浴热击90 s，迅速冰浴1-2 min。每管加400 μL LB培养基，37℃复苏60 min。5 000 r/min离心6 min，弃上清400 μL，剩余的涂布至含100 μg/mL Kan的LB琼脂平板上，37℃培养12-16 h至单菌落出现。

1.2.6 PCR检测阳性菌 挑取平板上的单菌落于3 mL（含100 μg/mL的Amp）LB培养基中，37℃300 r/min振摇培养过夜。取1 μL菌液作模板进行PCR检测。检测阳性后送武汉擎科测序公司进行测序。测序结果与GenBank序列一致的菌液可以直接扩大培养，提取去内毒素质粒。

1.2.7 超纯质粒提取 采用Omega公司Endo-free Plasmid Mini Kit II试剂盒提取质粒并将得到的质粒进行双酶切，经琼脂糖凝胶电泳对酶切片段进行初步验证。

1.2.8 细胞转染及Western blot分析 按照Invitrogen公司脂质体2000的使用说明书，将构建的重组质粒pIRES2-EGFP-CD151、pIRES2-EGFP-CD163转染到6孔板上处于对数生长期的Marc 145细胞，无双抗培养基培养48 h后在荧光显微镜下观察荧光表达情况，并收集细胞提取蛋白进行Western blot分析。

2 结果

2.1 CD151和CD163基因的PCR扩增

利用PCR方法从猪PAM细胞cDNA中扩增CD151和CD163基因，电泳结果表明，扩增产物大小与预期的结果相符，C151为762 bp，CD163为3 333 bp（图1）。测序结果表明，克隆的CD151和CD163基因片段均含有该基因完整的编码区序列，也包含信号肽序列。

图1 目的基因DNA片段电泳结果

2.2 pIRES2-EGFP-CD151和pIRES2-EGFP-CD163重组质粒的鉴定

将构建的真核表达质粒用Sal I和Kpn I进行双酶切，可以分别得到约5.3 kb、762 bp片段和5.3 kb、3 300 bp片段（图2），进一步证实了阳性重组质粒。测序结果经Blast软件比对分析，上述结果与NCBI公布序列一致（含信号肽编码区），表明构建载体成功。

图2 重组质粒双酶切结果

2.3 细胞转染及Western blot分析结果

细胞转染48 h后在荧光显微镜下可以观察到明亮的绿色荧光表达（图3）。Western blot结果（图4）表明，与对照组（未转染组）相比，稳定转染单一受体蛋白或CD151、CD163共转染细胞中目的蛋白表达水平均高于未转染细胞组，共转染组较单一转染组同一目的蛋白表达水平略低。

3 讨论

PRRSV 侵染靶细胞的先决条件是实现与宿主细胞的吸附，而宿主细胞表面的受体是完成这种吸附过程必不可少的［12，13］。研究发现，CD151分子无论是在体外还是体内都能与PRRSV的3'非编码区相结合，猴抗CD151多克隆抗体可以完全阻断PRRSV对MARC-145细胞的感染［14］。同时，CD15l分子在PRRSV易感细胞（如PAM、MARC-145、MA-104）中广泛存在，而在BHK、MDBK等不敏感细胞中不表达［14］，说明CDl51在PRRSV体外研究中扮演着重要角色。大量研究表明，猪肺泡巨噬细胞上的CD163分子可以使PRRSV非允许细胞系PK-15获得感染PRRSV并产生子代病毒粒子的能力。表明

CD163分子不仅可以介导病毒的吸附，还可以介导PRRSV的复制产生子代病毒，是PRRSV感染PAM细胞必不可少的受体分子［15-17］。因此，本研究将CD151和CD163作为研究对象，进行真核表达载体构建。

图3 细胞转染

图4 Western blot 分析结果

在构建载体的过程中采用pIRES2-EGFP双基因表达载体，该载体带有的增强型绿色荧光蛋白（Enhanced green fluorescent protein，EGFP）编码基因，是一种优化的突变型绿色荧光蛋白，其产生的荧光较普通绿色荧光蛋白强35倍［18］，大大增强了其报告基因的敏感度，且荧光强度及稳定性强，目前得到广泛应用。pIRES2-EGFP还含有CMV强启动子和SV40 poly A加尾信号，前者可增强外源基因的表达，后者可增强mRNA的稳定性及转录效率。该载体还携带新霉素抗性基因，提供了G418筛选的标志，便于转染细胞的稳定筛选。本研究将编码CD151和CD163的 cDNA插入到表达荧光蛋白的pIRES2-EGFP的多克隆位点处，通过转化、扩增和单酶切、双酶切鉴定，成功地构建了含有CD151和CD163目的基因和荧光蛋白报告基因的质粒pIRES2-EGFP-CD151和pIRES2-EGFP-CD163。它的应用可以使转染细胞同时表达目的蛋白和绿色荧光蛋白，所以它不仅能导入外源性目的基因，而且可利用荧光蛋白的表达对转染结果进行直观、及时地观察和检测。

4 结论

本研究成功克隆了 PRRSV 感染细胞过程中的两个重要的受体CD151和CD163的全长编码区域，包含了起始密码子、终止密码子和信号肽。信号肽的存在保证了表达产物正常分泌到胞外。在此基础上构建的猪CD151和CD163基因真核表达载体经酶切鉴定、序列分析完全正确，为进一步研究PRRSV两个最重要的受体 CD163 和CD151在其感染过程中的作用奠定了基础，有助于了解 PRRSV 侵入的过程，揭示 PRRSV 感染靶细胞的分子机制。

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（责任编辑 李楠）

Construction of Eukaryotic Expression Vector for the CD151 and CD163 Receptor Proteins of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus

Ruan Zheng1，2Li Jie1Liu Kaiwu2Wang Lianfang1Hua Juan1Hu Xiaoming3Liu Jie1，3Huang Haijun1，4
（1 .Wuhan Institute of Animal and Veterinary Science，Wuhan 430208；2. Wuhan Animal Disease Prevention and Control Center，Wuhan 430023；3. Key Laboratory of Swine Breeding and Genetics，Ministry of Agriculture & Key Laboratory of Agricultural Animal Genetics，Breeding and Reproduction（Huazhong Agricultural University），Ministry of Education，Wuhan 430070；4. Wuhan Bureau of Animal Husbandry and Veterinary，Wuhan 430023）

In order to study the interaction mechanism between the PRRSV and cell receptors, the CD151 and CD163 code fragments were obtained from PAM cells by PCR. These PCR products were digested with Sal I and Kpn I, then inserted into pIRES2-EGFP vectors separately to construct eukaryotic expression plasmid pIRES2 EGFP - CD151 or pIRES2 EGFP - CD163. These vectors were identified by the methods of restriction enzyme digestion, PCR and sequencing. Marc 145 cells transfected with CD151 or CD163 or CD151/CD163 expressed strong green fluorescence, which was further confirmed by western blot. The successful establishment of eukaryotic expression vectors of CD151 and CD163 provides the material foundation for the further exploring the synergistic effect of CD151 and CD163 in the process of PRRSV infection, especially to the further study of PRRS virus invasion and the host identification.

Porcine reproductive and respiratory syndrome CD151 CD163 Eukaryotic expression vector Cell transfection

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2014.12.032

2014-09-22

国家自然科学基金项目（31201938），武汉市科技局项目（2013020705070350-9，2013020705070350-14），武汉市农科院创新项目（CX201309），武汉市农科院青年英才项目（YC201101）

阮征，男，学士，高级兽医师，研究方向：动物疫病防控；E-mail：paper2006@sina.cn

黄海军，男，博士，高级畜牧师，研究方向：动物生物技术与疫病防控；E-mail：hygene@qq.com