噬菌体治疗中细菌对噬菌体的抗性

蔡刘体 陈兴江 刘艳霞 石俊雄

（贵州省烟草科学研究院 中国烟草分子遗传重点实验室，贵阳 550081）

用抗生素治疗细菌性病原菌感染已经有几十年历史，而且是非常好的有效治疗。然而，随着抗生素的广泛使用，包括正常的和不正常的使用，对细菌性病原菌而言已经形成了强大的选择性压力，致使细菌对抗生素出现了耐/抗药性［1]。细菌通常只需要几对基因就能对常用的抗生素产生耐/抗药性，这些抗性基因通常可以在细菌的遗传元件例如共轭质粒之间水平转移［2]，而且一个单一的元件可以激发对不同抗生素的抗性［3]。此外，当耐/抗药性出现之后，即使在抗生素不存在的情况下，质粒也可以在细菌群体中扩散和保持，这种情况表明减少抗生素的使用也不太可能对耐/抗药性情况有所帮助［4]。噬菌体（Bacteriophage，phage）是感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物的病毒的总称，其中烈性噬菌体是细菌的天然“杀手”，具有杀死和清除细菌的能力。但是细菌也能获得对噬菌体侵蚀的抵抗力，如在噬菌体附位点产生突变，或把噬菌体染色体整合到细菌基因组中，使得噬菌体对其失去感染能力。随着耐/抗药性细菌的增多，人们依然期望利用噬菌体治疗作为替代传统抗生素制剂的有效替代方法之一，也就是说选择噬菌体治疗耐/抗药性细菌性病原菌的感染。

1 噬菌体治疗的优势和难点

与抗生素治疗相比较，利用噬菌体治疗细菌性病害有其潜在优势：噬菌体只针对其特定的细菌病原菌作为宿主，因此噬菌体治疗专一性强且无副作用，不会破坏正常菌群［5，6]；噬菌体的存活和复制都是依赖其宿主细菌，由于噬菌体复制数量大周期短，每个裂解周期都会产生大量的子代噬菌体，因此噬菌体制剂在治疗中用量少，且具有放大效应［7，8]。另外，对于已经具有抗生素或化学农药耐/抗药性的细菌性病原菌株系的感染，利用噬菌体治疗尤其值得期望。

虽然噬菌体治疗具有大的潜在优势，但是在噬菌体治疗中也存在难点，尤其是在协同进化中细菌对噬菌体产生抗性的问题。研究表明，在噬菌体的压力驱动下，细菌能通过多种机制产生或获得耐/抗性，包括已经报道的吸附抑制、DNA 穿入阻滞、限制-修饰（Restriction-modification，R-M）系统、规律成簇间隔短回文重复序列（Clustered regularly interspaced palindromic repeats，CRISPR）系统及顿挫感染［9，10]，即使是在细菌数量相对比较小的群体中（如108的细菌数量），细菌能快速的对噬菌体产生抗性［11]。正因为人们对噬菌体治疗的优势及前景的期望，同时也对细菌病原体对噬菌体抗性的担心、噬菌体治疗存在的争议一致持续着。目前大家关注的一个问题是，虽然细菌对噬菌体产生抗性的机制和对化学抗生素产生抗性的机制有很大的区别。但是从长期治疗的角度看会不会导致相同的结果：治疗制剂不再能控制耐/抗性细菌病原菌的繁殖从而导致治疗无效。

2 细菌对噬菌体抗性问题的争议

在研究过程中，细菌对噬菌体抗性能快速的出现，此后噬菌体治疗倡导者们通常利用混合噬菌体的优点，在混合噬菌体中包含有多种类型的能感染同一种细菌或同一个细菌株系的噬菌体，从而使出现抗性细菌细胞的可能性大大降低［12，13]。然而，还有一个值得关注的问题是，混合噬菌体的广泛使用是否会导致抗混合噬菌体的抗性细菌病原菌株系的产生，也许与抗生素使用结果相似，在噬菌体制剂使用了几十年之后，可能出现众多的细菌性病原菌对不同的混合噬菌体产生抗性，导致噬菌体治疗的困难［14]。正如Krylov等［15]最近建议，为防止具有广谱性的混合噬菌体的细菌出现，在噬菌体治疗中最好使用单一的裂解性、特异性感染病原菌的噬菌体。

通常认为噬菌体驱动细菌的进化［16]，在噬菌体的压力下，迫使在细菌群体中产生对噬菌体具有适应性的细菌，尤其是对噬菌体具有抗性的细菌。噬菌体一般宿主范围比较窄，因此在一定程度上，通常可以用一组特异性的噬菌体来区分相关性很近的细菌株系［17]。即使是宿主范围窄，抗性的持续选择和经常提及的细菌与噬菌体之间的竞争性进化［18]，也许可能使得分离有效感染具有多噬菌体抗性的细菌性病原菌株系变得困难。

在循环的协同进化中，噬菌体能影响细菌的进化［18]。在协同进化中，细菌能获得对噬菌体的抗性，形成对该噬菌体具有抗性的细菌，然而随着协同进化的循环，噬菌体能重新获得对噬菌体具有抗性细菌的侵染能力，而且，研究表明细菌回复到噬菌体敏感型的频率相对比较低［19，20]。细菌的细胞表面成分进化比较快速，这可能是细菌细胞表面成分被噬菌体作为宿主附着点利用的原因，也是细菌病原菌改变其免疫系统的结果。研究表明即使在实验室条件下，细菌与裂解性噬菌体的竞争性协同进化会加速参与协同进化物种之间的分子进化速率［16]。虽然不是所有的噬菌体都能重新获得感染抗性宿主的能力［18]，在这种协同进化循环的情况下，只要噬菌体的宿主范围不断的演变，至少有一些噬菌体能具有感染细菌的能力［18]。

Ormälä等［21]认为，尽管上面提到的细菌对噬菌体能快速产生抗性，但是一些研究显示具有噬菌体抗性的超级细菌不太可能出现。首先，在实验室条件和在自然栖息地情况下，有实验表明病毒（噬菌体）适应进化的宿主或者宿主适应进化的病毒（噬菌体）是周期性的演变。特别是Gomez 和Buckling［22]阐述土壤中的细菌对当代噬菌体的抗性比对前代或者后代的噬菌体抗性要强。宿主对噬菌体感染的抗性只是细菌的一个暂时特性。同样的，噬菌体对目前的细菌感染力比对过去或者以后的宿主的感染力弱。这表明不会因此使得只有协同进化的噬菌体才能保持感染它们宿主的能力；反过来，这也表明噬菌体选择不会驱动遗传分化，还可以防止其它的噬菌体在特定的宿主中复制。另外，在很多情况下细菌获得噬菌体抗性是有代价的［23，24]，对细菌而言，在其区域环境中不再出现的噬菌体，仍然对其保持噬菌体抗性是明显不利的［22]。而且，具有噬菌体抗性的细菌通常缺失具有细菌性致病力的细胞表面特征［25，26]。具有噬菌体抗性的细菌，假使不被噬菌体杀死，大多也变成了无致病力的细菌。然而，有时候一直观察不到细菌对噬菌体产生抗性的代价［27]，表明至少有些情况下细菌的抗性表现型可以持续。

大多数细菌被认为是在它们目前的环境中与噬菌体竞争的条件下不断进化［11]。尽管这是一个事实，即使持续使用噬菌体致使一个细菌群体对特定的混合噬菌体有了永久性抗性，但是噬菌体感染模式的地理学研究表明新的感染性噬菌体仍然可以有效的使用。Flores等［28]通过分析38个关于宿主-噬菌体相互作用的独立研究，结果表明噬菌体能感染许多从不同地方分离的宿主细菌株系，他们指出的噬菌体感染模式暗示“难被感染”的宿主被“通用”噬菌体感染而不是被专一性的噬菌体感染，这表明尽管它们缺乏最近的接触，但是噬菌体仍然能保持对地球另一端宿主细菌细胞的感染力。Wolf等［29]研究表明他们在2003年分离到能感染一个单一的淡水宿主细胞（鞘氨醇单胞菌）的噬菌体，宿主细胞是在1985年分离的，而噬菌体是在2003年从相距分离宿主细胞很远的地方分离的。Ormälä等［21]从芬兰分离的噬菌体中有可以感染20世纪60年代从不列颠分离的宿主。这些和其它例子表明一个单一的噬菌体能保持感染世界各地的宿主细菌，一个单一的细菌能作为多个远距离其它地方分离的噬菌体。

3 展望

以上关于噬菌体治疗的抗性问题争论中暗示，尽管噬菌体治疗广泛使用，但对病原菌细菌而言，不能再发现具有感染能力的新噬菌体的情况是不太可能出现。从历史的角度看，噬菌体治疗已经失败了一次［30]，我们再次尝试的时候需要小心谨慎。最近Denomy 等［31]研究发现感染绿脓假单胞菌噬菌体编码的抗CRISPR基因可能是噬菌体克服高度普遍的CRISPR/Cas（规律成簇间隔短回文重复序列相关系统）系统的机制，抗CRISPR基因的存在为阐明CRISPR/Cas功能性机制提供了新的方向，并为理解噬菌体和细菌的共进化提供了新的观点。Seed等［32]研究发现霍乱菌（Cholera bacteria）的一种噬菌体能“偷走”细菌的功能免疫系统，并利用它关闭霍乱菌对抗噬菌体的防御体系，从而杀死霍乱菌，繁殖更多的噬菌体后代，这样又能杀死更多的霍乱菌。他们的研究［32]首次证明了这种病毒：噬菌体能够获得完全功能性的适应性免疫系统，这项研究对于噬菌体疗法而言具有重要的意义。

因此，在新的“传统”抗生素发展和开发已经变得更难的时候，为了充分利用噬菌体治疗的优势，克服噬菌体治疗的难点，使噬菌体制剂治疗更具安全性和可控性，在噬菌体的生物特性、噬菌体-细菌的协同进化、噬菌体-细菌-宿主三者之间的相互作用关系等方面需要做更多的研究。

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