嗜水气单胞菌转录调控蛋白基因的克隆与序列分析

李雪 胡秀彩 兰云 沈晓静 吕爱军 朱爱华

（江苏师范大学生命科学学院，徐州 221 116）

嗜水气单胞菌（A. hydrophila）是一种典型的鱼、畜、人共患病病原菌［1，2]，主要致病因子包括外毒素、胞外蛋白酶等，并与转录调控蛋白AhyR基因有关［3]。研究表明，嗜水气单胞菌AhyR基因调控溶血素、胞外蛋白酶等产生［4，5]。毕志香等［4，6]构建嗜水气单胞菌J-1菌株AhyR基因突变株J-1△AhyR，发现AhyR基因与蛋白酶、溶血素、DNA酶等主要致病因子表达有关。嗜水气单胞菌AhyR基因突变阻止产生N-酰基高丝氨酸内酯，从而进一步抑制蛋白酶的产生［5]。Swift等［7]报道嗜水气单胞菌AhyR蛋白能够促使胞外蛋白酶较早表达，有效防御病原菌侵入抵制感染。此外，AhyR蛋白与细菌群体感应信号调控蛋白LuxR功能类似，参与调控生物膜形成以及胞外蛋白酶产生［8，9]。关于鱼源嗜水气单胞菌AhyR基因的序列分析及其结构预测，目前尚未见文献报道。本 研究从嗜水气单胞菌Zf1菌株中克隆获得AhyR基因，并对其编码蛋白进行生物信息学分析，有助于理解嗜水气单胞菌的分子致病机理。

1 材料与方法

1.1 材料

嗜水气单胞菌Zf1菌株由本实验室保藏。细菌基因组DNA提取试剂盒购自上海生工生物工程有限公司，pMD18-T Vector购自TaKaRa公司，UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒、PCR扩增试剂均购自上海捷瑞生物工程公司。

1.2 方法

1.2.1 引物设计与合成 参考嗜水气单胞菌AhyR基因序列（登录号：YP_855090），设计特异性上下游引物（AhyR-F：CGATTGCGAAAGCGATAA；AhyR-R：CTGCTGAGCCATTGGTTTT）用于PCR扩增Zf1菌株AhyR基因，引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2.2 Zf1菌株AhyR基因克隆 参考李雪等［10]方法，将Zf1菌株接种于LB液体培养基中，28℃培养12 h。取1 mL菌液用于提取基因组DNA，具体操作参照细菌基因组DNA提取试剂盒说明书。将提取到的基因组DNA用1%琼脂糖凝胶电泳检测，-20℃保存备用。PCR扩增采用10 μL体系：提取的Zf1菌株基因组DNA模板1.0 μL，上下游引物各0.5 μL，Master Mix 5.0 μL，ddH2O 3 μL。PCR循环条件为：94℃预变性2 min，94℃变性45 s，50℃退火45 s，72℃延伸2 min，经30个循环后72℃再延伸10 min。得到目的条带后，按照UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒说明书回收目的基因。将胶回收得到的DNA片段用1%琼脂糖凝胶电泳检测，-20℃保存备用。将AhyR基因胶回收产物与pMD18-T载体连接，转化到DH5α感受态细胞，阳性克隆菌样送上海生工测序。

1.2.3 基因序列及其结构分析 用Edit seq推测氨基酸序列，利用Motif Scan、blastp程序预测结构域，NetPhos 2.0 Server预测磷酸化位点［11]。通过邻接法（Neighbor-Joining），应用MEGA 5.1软件构建系统发育进化树分析。将蛋白氨基酸序列提交SWISSMODEL预测三级结构，用RasMolVersion 2.7.5.2查看蛋白三级结构，并用拉马钱德兰图（Ramachandran plot）检测蛋白模型的合理性。

2 结果

2.1 Zf1菌株AhyR基因克隆及序列分析

PCR扩增得到一条特异性条带（图1），测序获得AhyR基因大小为1 063 bp，引物序列见图2，推测ORF编码260 aa；查找结构域发现AhyR蛋白18-168 aa区域为自体诱导物结合域（PF03472），176-241 aa区域为LuxR型螺旋-转角-螺旋DNA结合结构域（PS50043），183-227 aa区域为DNA结合域（PF04967）（图3）；预测AhyR蛋白含有13个磷酸化位点，其中有8个丝氨酸（15S、62S、144S、145S、156S、173S、200S、227S）、3个苏氨酸（30T、184T、188T、）和2个酪氨酸（161Y、231Y），进一步预测酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点（15S、173S、184T、199T）和蛋白激酶C磷酸化位点（173S、184T、210T、222T）（图4）。

图1 AhyR基因的PCR电泳

2.2 AhyR基因蛋白序列比对及系统进化树分析

对AhyR蛋白进行多重序列比对表明气单胞属不同菌种AhyR氨基酸序列高度保守，与杀鲑气单胞菌（A. salmonicida）、维隆气单胞菌（A. veronii）、豚鼠气单胞菌（A. caviae）、中间气单胞菌（A. media）、简达气单胞菌（A. jandaei）序列同源性分别为100%、99.62%、99.23%、98.85%、94.23%。构建系统发育进化树分析显示AhyR为LuxR同源蛋白之一，AhyR蛋白与嗜水气单胞菌（登录号YP_855090）的AhyR蛋白亲缘性最近，自然聚为一支（图5）。

2.3 AhyR基因编码蛋白三级结构预测

图2 Zf1菌株AhyR基因的上下游引物测序图谱

图3 AhyR蛋白blastp保守结构域图

图4 AhyR蛋白磷酸化位点预测

进一步分析AhyR蛋白三级结构，确定以群体感应控制阻遏物的A链（PDB：3SZT_A）为模板，该蛋白与模板相似性达28.40%，通过SWISSMODEL在线比较建模结果，如图6-A所示，AhyR蛋白主要由15个α螺旋、5个β折叠和19个转角构成，该三级结构与二级结构序列特征分析结果基本一致；图6-B显示LuxR型螺旋-转角-螺旋结构域主要以α螺旋分布在三级结构C端外侧。拉马钱德兰图检测结果（图7）表明有93.9%氨基酸序列位于最适宜区，5.9%氨基酸序列位于允许区，证实AhyR基因推导蛋白的三级结构模型合理。

3 讨论

图5 邻接法构建AhyR蛋白的系统进化树

图6 AhyR蛋白的3D结构预测图

嗜水气单胞菌致病因子主要包括外毒素、胞外蛋白酶等，还与转录调控蛋白AhyR基因有关［3]。AhyR蛋白在嗜水气单胞菌蛋白酶活性调节中起重要作用，促使胞外蛋白酶较早表达，有效防御病原菌侵入抵制感染［7]。Bi等［4]利用自杀性重组质粒pJP-AhyR插入诱变嗜水气单胞菌J-1菌株AhyR基因，构建该基因突变株J-1△AhyR，证实AhyR基因与嗜水气单胞菌致病因子表达有关。Kirke等［8]报道嗜水气单胞菌AhyR蛋白属于LuxR型家族调控蛋白之一，AhyR基因能够调节N-酰基高丝氨酸内酯合成酶生成，与生物膜形成和细胞外蛋白酶产生有关。LuxR调控蛋白在革兰氏阴性菌群体感应系统中与自体诱导物（Autoinducers，AI）信号传递分子结合［12]，进一步调控细菌多种生理活动［4-9]。此外，细菌转录调控蛋白PhoB、TraR与LuxR蛋白DNA结合域高度保守［13，14]。Shindoh等［13]认为大肠杆菌PhoB转录调控蛋白DNA结合域与磷酸盐饥饿诱导激活基因调控有关。Vannini等［14]研究发现根癌土壤杆菌（Agrobacterium tumefaciens）TraR蛋白基因结合区位于DNA结合域和GAF/PAS结构域之间。AhyR蛋白N端自体诱导物结合域为信号分子结合区域，C端DNA结合域能与目的基因特异性结合，以调控转录活性［14，15]。本研究采用PCR方法扩增得到嗜水气单胞菌Zf1菌株AhyR基因序列，预测含有自体诱导物结合域和LuxR型螺旋-转角-螺旋DNA结合结构域，这与国外文献报道［13，14]一致。此外还发现，以上两个功能域为LuxR型家族调控蛋白独有结构域，有待于进行AhyR基因功能的生物学验证。

图7 AhyR蛋白片段3D模型的拉马钱德兰图分析

细菌转录调控蛋白（如UhpA、AhyR、LuxR等）磷酸化参与基因转录调控、细胞凋亡等生理病理过程，在感染致病过程中起重要调控作用［16-20]。因此，预测嗜水气单胞菌AhyR蛋白的磷酸化位点有助于研究AhyR蛋白功能。Dahl等［18]研究大肠杆菌转录调控蛋白UhpA磷酸化后，能够结合到糖磷酸转运蛋白UhpT启动子，实现UhpT蛋白表达。Ottosen等［19]鉴定单纯疱疹病毒VP16转录调控蛋白5个磷酸化位点（18S、353S、375S、411S、452S），其中375S在VP16与Oct-1相互作用过程中发挥重要作用，这可能与病毒介导早期基因启动及转录调控功能有关。Jeličić等［20]诱导酵母转录调控蛋白（Gal4）DNA结合域中7个丝氨酸位点突变，预测转录活性和与DNA结合能力，发现2个磷酸化位点（22S、85S），认为DNA结合域中的丝氨酸介导转录机制中蛋白质相互作用，从而稳定激活子Gal4蛋白。本研究预测Zf1菌株AhyR蛋白含有13个磷酸化位点发现，173S、184T为酪蛋白激酶Ⅱ和蛋白激酶C磷酸化位点。此外，对气单胞属AhyR蛋白序列比对，结果表明氨基酸序列同源性高于90%，系统发育进化树分析显示AhyR为LuxR同源蛋白，这与郑世超等［21]报道结果基本一致。进一步分析AhyR蛋白三级结构，以及拉马钱德兰图检测表明AhyR基因推导蛋白的三级结构模型合理，有助于进一步试验验证AhyR蛋白功能及其分子调控机制。

4 结论

获得嗜水气单胞菌Zf1菌株AhyR基因大小为1 063 bp，推导编码260 aa，发现含有自体诱导物结合域（PF03472）、LuxR型螺旋-转角-螺旋DNA结合结构域（PS50043）及13个磷酸化位点。AhyR蛋白三级结构显示LuxR型螺旋-转角-螺旋结构域主要以α螺旋分布在C端外侧，与拉马钱德兰图检测分析AhyR蛋白空间结构基本一致。

［1] Yadav AS, Kumar A. Prevalence of enterotoxigenic motile aeromonads in children, fish, milk and ice-cream and their public health significance［J] . The Southeast Asian Journal of Tropical Medicine and Public Health, 2000, 31（1）：153-156.

［2] 蔡丽娟, 徐宝青, 林启存. 水产致病性嗜水气单胞菌耐药性比较与分析［J] . 水产科学, 2011, 1（30）：42-45.

［3] 邱军强, 杨先乐, 等. 嗜水气单胞菌毒力因子特性及作用机理研究进展［J] . 中国病原生物学杂志, 2009, 4（8）：616-619.

［4] Bi ZX, Liu YJ, Lu CP. Contribution of AhyR to virulence ofAeromonas hydrophilaJ-1［J] . Research in Veterinary Science,2007, 83（2）：150-156.

［5] Swift S, Karlyshev AV, Fish L, et al. Quorum sensing inAeromonas hydrophilaandAeromonas almonicida：Identification of theLuxRIHomologsAhyRIand their cognate N-Acylhomoserine lactone signal［J] . Journal of Bacteriology, 1997, 179（17）：5271-5281.

［6] 毕志香, 刘永杰. 嗜水气单胞菌转录调控蛋白基因（ahyR）突变株的构建及特性分析［J] . 农业生物技术学报, 2006, 14（1）：55-59.

［7] Swift S, Lynch MJ, Fish L, et al. Quorum sensing-dependent regulation and blockade of exoprotease production inAeromonas hydrophila［J] . Infection and Immunity, 1999, 67（10）：5192-5199.

［8] Kirke DF, Swift S, et al. TheAeromonas hydrophilaLuxR homologue AhyR regulates the N-acyl homoserine lactone synthase, AhyI positively and negatively in a growth phase-dependent manner［J] .FEMS Microbiology Letters, 2004, 241（1）：109-117.

［9] Lynch MJ, Swift S, Kirke DF, et al. The regulation of biofilm development by quorum sensing inAeromonas hydrophila［J] . Environmental Microbiology, 2002, 4（1）：18-28.

［10] 李雪, 王艺, 兰云, 等. 嗜水气单胞菌气溶素基因克隆与蛋白结构预测［J] . 生物技术, 2013, 23（2）：4-9.

［11] 张林华, 邱红林, 刘超, 等. 天山雪莲PsaH基因的克隆及序列分析［J] . 生物技术通报, 2013（6）：75-79．

［12] Nasser W, Reverchon S. New insights into the regulatory mechanisms of the LuxR family of quorum sensing regulators［J] .Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2007, 387（2）：381-390.

［13] Shindoh K, Maenaka K, Akiba T, et al. Crystallization and preliminary X-ray diffraction studies on the DNA-binding domain of the transcriptional activator protein PhoB fromEscherichia coli［J] .Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography,2002, 58（Pt 10 Pt 2）：1862-1864.

［14] Vannini A, Volpari C, Gargioli C, et al. The crystal structure of the quorum sensing protein TraR bound to its autoinducer and target DNA［J] . EMBO Journal, 2002, 21（17）：4393-4401.

［15] Egland KA, Greenberg EP. Quorum sensing inVibrio fischeri：elements of the luxl promoter［J] . Molecular Microbiology, 1999,31（4）：1197-1204.

［16] González JE, Keshavan ND. Messing with bacterial quorum sensing［J] . Microbiology and Molecular Biology Reviews, 2006,70（4）：859-875.

［17] Correa NE, Lauriano CM, McGee R, et al. Phosphorylation of the flagellar regulatory protein FlrC is necessary forVibrio choleraemotility and enhanced colonization［J] . Molecular Microbiology,2000, 35（4）：743-755.

［18] Dahl JL, Wei BY, Kadner RJ. Protein phosphorylation affects binding of theEscherichia colitranscription activator UhpA to the uhpT promoter［J] . Journal of Biological Chemistry, 1997, 272（3）：1910-1919.

［19] Ottosen S, Herrera FJ, Doroghazi JR, et al. Phosphorylation of the VP16 transcriptional activator protein during herpes simplex virus infection and mutational analysis of putative phosphorylation sites［J] . Virology, 2006, 345（2）：468-481.

［20] Jeličić B, Nemet J, Traven A, et al. Solvent exposed serines in the Gal4 DNA binding domain are required for promoter occupancy and transcriptional activationin vivo［J] . FEMS Yeast Research,2013, 14（2）：1567-1356.

［21] 郑世超, 罗瑛, 鲁涛. LuxR 家族调控蛋白的结构及功能［J] .生命科学, 2010, 22（9）：886-895.