未成熟卵母细胞冻存

姜李乐，韦多，张翠莲

（郑州大学人民医院生殖医学研究所，郑州 450003）

在人类生育力保存方面，冷冻保存为辅助生殖技术不受空间、时间的限制提供了可能。胚胎冷冻、卵母细胞冷冻、卵巢组织冷冻是女性生育力保存的3项基本方案。三者各有优缺点与局限性，其中卵母细胞冷冻因其特点和难点是现代辅助生殖技术的重要组成之一，广受关注［1］。介于成熟卵母细胞的来源有限、对低温非常敏感的特点，提出冷冻纺锤体形成前的第1次减数分裂前期双线期（GV期）或第1次减数分裂中期（MI期）的未成熟卵母细胞。冷冻保存未成熟卵母细胞有着广阔的发展前景。本文从冷冻未成熟卵母细胞的优势、冷冻方法及影响因素等方面予以综述。

一、冷冻未成熟卵母细胞的优点

1.与冷冻胚胎相比：冷冻未成熟卵母细胞能够解决胚胎冷冻临床应用局限性大的问题。目前胚胎冷冻保存已经作为一项成熟有效的辅助生殖技术在临床上广泛应用。但胚胎的产生常规需要行促性腺激素刺激卵巢，提取成熟卵母细胞以及在体外受精等过程。通常需要好几周甚至几个月的准备时间，而收集未成熟卵母细胞10d之内可以完成。冷冻胚胎并不适合不能延迟放化学治疗的晚期恶性肿瘤患者、有激素使用禁忌症的患者、幼女等［2］。同时，冷冻未成熟卵母细胞还缓解了胚胎冷冻存在的伦理、法律、道德、宗教多方面社会问题［3－4］。

2.与冷冻成熟卵母细胞相比：未成熟卵母细胞的来源更广，可在月经周期任何时间取卵，而成熟卵母细通常仅来源于体外受精（IVF）周期。收集未成熟卵母细胞减少了患者进行超促排卵方案的经济与时间花费，避免了卵巢过度刺激综合征（OHSS）的发生。另外，未成熟卵母细胞获取容易，常规IVF周期中平均能得到15%～20%的裸化的未成熟卵［5］，多囊卵巢综合征（PCOS）患者的未成熟卵母细胞，妇科手术穿刺得到未成熟卵母细胞，良性妇科疾病切除的卵巢组织也都可以得到未成熟卵母细胞。成熟卵母细胞染色体排列规律，胞浆内由微管构成的纺锤体结构特殊且温度敏感性高，冷冻降温中易解聚，造成非整倍体、双雌受精发生率高以及透明带硬化、受精障碍发生率增加。而未成熟卵母细胞（GV或MI期）没有形成纺锤体结构，体积较小且染色体被核膜包绕，GV／MI期卵母细胞染色质特定的存在状态在冻融中提供了保护，染色体损伤的可能性小，对低温不敏感，在冷冻过程中易脱水，避免了卵母细胞因纺锤体结构受到低温或冷冻保护剂的冲击而导致遗传物质损伤［6］。Al－Khtib等［7］的研究显示玻璃化冷冻未成熟卵母细胞在一定程度上并不影响基因的印迹表达。与成熟卵母细胞相比，冻存未成熟卵母细胞是更好的选择［8］。

二、不同时期未成熟卵母细胞特点比较

未成熟卵母细胞包括GV期和MI期两大类，GV期卵母细胞的典型特征是含有1个巨大的生发泡，卵母细胞结构中有两层大的细胞膜，即细胞膜和生发泡膜。在进行冷冻及复苏过程中，两层膜对渗透压的变化有着较强的缓冲作用，很大程度上降低了GV期卵母细胞胞浆膜崩解率，GV期卵母细胞与MI期相比，更能耐受低温及冷冻保护剂的影响，MI期卵母细胞因不存在生发泡的特殊结构，而细胞膜易遭到冷冻破坏［9］。

三、冷冻未成熟卵母细胞的方法选择

1.程序化慢速冷冻法：程序化慢速冷冻法是一种经典的冷冻方法，比较适合体积大的细胞。使用低浓度冷冻保护剂，在程序冷冻仪控制下缓慢降温使细胞脱水，利用植冰方法越过细胞的超冷阶段，进一步启动脱水过程，在进入液氮前使胞浆处于玻璃化状态，实现未成熟卵母细胞低温保存。但程序化慢速冷冻存在脱水不完全的问题，若未成熟卵母细胞在浸人液氮前还存在小冰晶，小冰晶会在复温过程骤然膨大损伤胞膜及胞内结构，造成细胞致命的伤害。几十年来，程序化冷冻方法发展缓慢，其复苏率较低，发育潜能相对差，文献统计的慢速冷冻卵母细胞来源的出生婴儿仅约百人［10］。

2.玻璃化冷冻法：玻璃化冷冻作为新兴技术，其基本原理是高浓度冷冻保护剂溶液以极快的速率降温，由液态转化为类似玻璃形态的非晶体化固体，这种玻璃化液在低温时黏稠度很高，但不结晶形成玻璃样固体，保留了正常的超微结构，维持了细胞内外离子、分子分布，很好地解决了程序化冷冻过程中容易去玻璃化和再结晶导致细胞损失的问题。在卵母细胞冷冻方面，Cao等［11］还证明了玻璃化冷冻方法比程序化慢速冷冻卵母细胞的复苏率、受精率、囊胚形成率高。Smith等［12］的前瞻性对照研究也得到了相似的结论，玻璃化冷冻卵母细胞的胚胎形成率及妊娠率与新鲜卵母细胞相似［13］。根据荟萃分析的结论，程序化慢速冷冻方法的每枚卵母细胞的出生率为2.3%，玻璃化冷冻方法的每枚卵母细胞的出生率为5.2%。在未成熟卵母细胞冷冻的研究上，罗莉等［14］也得到了未成熟卵母细胞玻璃化冻融组的复苏存活率、卵体外培养成熟（IVM）成熟率、受精率及卵裂率均高于慢速程序冻融组的结论。Catherine等［15］的研究也支持玻璃化冷冻是优于程序化慢速冷冻的选择。另外，玻璃化冷冻操作简便，节省人力时间，不需像程序化冷冻化那样配备特殊仪器，已经成为最有发展前途的冷冻保存技术［16］。

四、冷冻保护剂的选择

在冷冻过程中添加冷冻保护剂，达到延长细胞脱水过程，避免冰晶的形成，减少冷冻损伤的作用。分为渗透性冷冻保护剂和非渗透性冷冻保护剂两大类，渗透性冷冻保护剂通过降低溶液的冰点，增加溶液的粘性，稀释溶液中的溶质［17］，主要有丙二醇（PROH）、二甲基亚砜（DMSO）和乙二醇（EG）等，三者渗透速率为EG＞PROH＞DMSO，非渗透性冷冻保护剂不能通过细胞膜，但可在细胞外形成渗透梯度，引起胞内水分外流，主要有蔗糖、海藻糖、葡萄糖和脂蛋白等。蔗糖是过去常用的非渗透性冷冻保护剂，添加蔗糖可以提高卵母细胞细胞外液渗透压，促进脱水，降低渗透性冷冻保护剂进入到卵母细胞内的量，又能在解冻时预防渗透性休克。早期曾认为冷冻保护剂会导致脱氧核糖核酸突变，DMSO将对成熟卵母细胞纺锤体造成较大损害，但新近Milliken等［18］的评估结果认为DMSO无遗传毒性，EG没有直接的遗传毒性，PROH有导致DNA损伤的可能。现阶段未成熟卵母细胞冷冻的方案研究开始关注降低冷冻保护剂的毒性，旨在使用最小浓度的冷冻保护剂以获得较稳定的解冻复苏率。现在普遍认为EG能够有效缩短复苏过程中的清除时间，是较为理想的冷冻保护剂。Tharasanit等［19］报道采用逐步分段式冷冻保护剂在未成熟卵母细胞冷冻中获得了较好的结果。最新Somfai等［20］的研究结果表明联合17.5%PROH和17.5%的EG能够确保良好的未成熟卵母细胞复苏存活率，且在后期发育中未观察到毒性效应。

五、冷冻载体的选择

玻璃化技术的冷冻载体依据冷冻物质是否直接接触液氮分为开放性载体和封闭性载体。使用开放性载体，标本直接接触液氮，冷冻复苏速度快、效率高，操作简便，但潜在的微生物污染风险是其最大缺陷［21］。封闭性载体，如拉细麦管和冷冻钩的出现杜绝了污染风险，但较长的封闭操作时间增加了未成熟卵母细胞在玻璃化液体内的留存时间，降低了冷冻效率，且复杂的操作对人员要求更高。回顾既往有限的几项有关使用开放性载体冷冻未成熟卵母细胞对其复苏存活率、未成熟卵体外培养成熟（IVM）后成熟率、受精率的研究，尚认为使用开放性载体可有效保存未成熟卵母细胞。目前尚缺乏人类胚胎及卵母细胞经液氮感染病毒或其它微生物的报道，大多数中心选用冷冻效率较高的开放性载体，有Cryloop、J.Y.straw、Cryotop、Cryotip、Cryoleaf、电镜铜网等［22］。对于动物研究，在详细比较了几种常用的冷冻载体，综合评价后，认为使用小型开放麦管（SOPS）是较好的哺乳动物未成熟卵母细胞冷冻载体［23］。

六、未成熟卵母细胞先冷冻后培养还是培养成熟再行冷冻

有关玻璃化冷冻体外成熟培养的人类未成熟卵母细胞在超微结构方面影响的研究结果表明先冷冻后培养（vIVM）组与先培养后冷冻（fIVM）组相比，卵母细胞成熟率低，退化率相对高［24］。有文献报道fIVM组可以达到与冷冻新鲜成熟卵母细胞相近的复苏率［25］，Yazdanpanah等［26］的研究发现也与前者相一致。透射电镜显示vIVM组皮质颗粒CGs大量地减少，同时卵母细胞胞质内出现空泡和小的线粒体滑面内质网聚集物。目前普遍倾向于先体外培养成熟后冷冻［27］，已经有相关临床妊娠的报道［28］。先养后冻可能会损失一定量的未成熟卵母细胞，及时冻存获取的未成熟卵母细胞有可能为患者提供更多的机会。综合考虑，先冻后养仍有一定的应用研究价值。

七、是否保留卵丘颗粒细胞

卵冠丘颗粒细胞与卵母细胞间存在着广泛的连接，对卵母细胞的成熟有重要的作用。在冷冻过程中保留颗粒细胞层是利于还是限制卵母细胞有多方研究，但仍存有争议。理论上保留完整地卵冠丘复合物，会对冷冻速率产生影响，颗粒细胞可能形成一种僵硬结构在冷冻脱水过程中影响卵母细胞的形态变化。研究认为颗粒细胞是否存在对卵母细胞的冷冻效果无明显影响［29］，但鉴于卵冠丘细胞对复苏后未成熟卵的体外成熟的重要作用，主张对要先行体外培养的未成熟卵母细胞，要保留完整卵冠丘复合物。同时考虑到冷冻复苏技术中颗粒细胞经吹打易脱去或造成细胞损伤，有引起复苏后的未成熟卵体外成熟阻滞的可能性，故在行冷冻复融操作时需谨慎把握每个细节。

八、未成熟卵母细胞体外成熟培养体系的新进展

未成熟卵母细胞体外成熟培养技术为未成熟卵母细胞的冷冻技术提供了技术基础，经过几十年的发展，IVM 技术已取得了一定进展［30］，从理论上讲，很多IVM 培养基已经接近体内环境以及提供了与自然生长相似的条件。体外培养时间、促成熟因子的添加浓度也更精确，新近研究在基础培养基中添加抗氧化剂［31］、减数分裂抑制剂等取得了较好的实验结果。进一步优化IVM体系，在体外培养过程中尽量保持卵母细胞生理结构和功能完整性［32］，将其与未成熟卵母细胞冷冻技术联合起来，促进核质发育同步是继续努力的方向［33］。

九、冷冻保护因子预处理

有学者主张使用冷冻保护因子（GSF）、抗冻蛋白等减小冷冻损伤，提高冷冻效率。Liang等［34］研究在玻璃化冷冻前使用细胞松弛素B（CB）预处理可以提高复苏存活率，但并不增加成熟率和胚胎发育潜能。Sprícigo等［35］主张在玻璃化冷冻前添加胆固醇载体 Methyl－β－cyclodextrin（MβCD），能够促进核成熟，减少玻璃化冷冻或应激冷刺激的损伤，同时提高卵母细胞质膜在玻璃化冷冻中的耐受性，相关研究不多，尚需更多的数据支持。

十、冷冻保存时间

通常认为在液氮（－196℃）条件下，细胞生物活性处于停滞态，液氮中唯一的损害因素是外界物理辐射造成的DNA结构破坏。理论上未成熟卵母细胞储存在液氮里是安全的，关于冷冻胚胎的研究认为延长冷冻保存时间并不影响胚胎质量［36］。卵母细胞冷冻多年后复苏，在受精率、卵裂率、胚胎质量及发育能力、种植率和婴儿出生率方面与新鲜卵母细胞相比无显著差异［37］。冷冻未成熟卵母细胞的保存时间缺乏相关报道，从实用的角度达成的共识一般为3～10年。

自1998年Tucker等［38］首次报道了GV期未成熟冻融卵母细胞体外培养成熟后移植孕育分娩一健康女婴以来，越来越多的生殖学家开始关注未成熟卵母细胞冷冻保存，尽管该项技术难度很大，但其应用前景广阔，随着基础研究和临床实践的不断推进，取得了一定成绩，已有数例妊娠分娩的报道［39］，但是总体妊振率是很低的。同时在远期安全性评估方面，IVM及冷冻技术都可能带来损伤引发染色体异常，多精受精和孤雌生殖的可能性相对增大［40］，目前冷冻对受精后胚胎的发育潜能及胚胎着床的影响尚不确切。重视对此项技术出生的婴儿的随访，加强遗传损伤的检测。可以将未成熟卵母细胞的冷冻保存看成由冷冻复苏技术、IVM培养、体外受精及胚胎发育等组成的一套体系，其中涉及每项技术都有再完善的空间，特别是IVM技术与冷冻技术的结合增加了技术难度。总的来看，未成熟卵母细胞的冷冻技术面临的挑战很大［41］，需要做更多更深入的基础与临床的研究。随着对卵母细胞结构，体内成熟及发育过程的复杂调节近一步认识，IVM培养体系的不断优化以及低温冷冻保存技术的完善发展，理想的未成熟卵母细胞冷冻方案有望达成共识，为女性生育力保存提供技术支持［42］。

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