胶质细胞源性神经营养因子与帕金森病的相关性研究进展

于丽丽, 田德蔷, 陈晓红, 赵志刚, 王慧媛

(1. 北京邮电大学医院 药剂科, 北京, 100876; 2. 首都医科大学附属北京天坛医院 药剂科, 北京, 100050)

PD是一种不能治愈的使人衰弱的神经退行性疾病[1], 临床表现为一组特殊的运动障碍症状(马达启动症状最常见，包括弯曲膝盖、踮脚尖步态、僵直腿轻偏瘫步态、Hoover′s 征麻痹或运动迟缓征)、快感缺乏(占15%)、手-眼协调受损等症状[2-5]。随着年龄和时间的增长，男性PD患者逐渐增多[6]。有研究[7]发现该病死亡率是每年0.25/十万居民，且大多为年龄>80岁的男性。GDNF是神经细胞生存和维持表型所必需的一种蛋白质，对PD有神经保护作用的一种潜在DA能保护因子。试验性的研究已经证实在与PD发病机制相关的异常凋亡和炎性机制中，GDNF参与DA合成、代谢酶缺失、线粒体功能紊乱、氧化应激和基因毒素反应。GDNF保护含儿茶酚胺的细胞不受毒性侵害，是有潜能的治疗PD疗法且正在进行的临床试验中是有效的[8-9]。

1 GDNF 家族配体、受体表达和信号传递

1.1 神经秩蛋白(NRTN)

GDNF配体家族目前包括4种营养因子: GDNF、Neurturin( NRTN)、Persephin(PSPN)及ARTNemin(ARTN)。NRTN可支持外周和中枢神经系统生长、维护和分化，目前正在进行对PD疾病的一系列临床研究。许多GDNF细胞发挥作用都是由绑定到GDNF家族的受体α1(GFRα1)启动，由多种细胞内信号通路介导，尤其大多数通过Ret酪氨酸激酶介导。GFRα1在纹状体中表达，是黑质多巴胺能投射的目标。Nikolai等[10]研究在成人纹状体(Str)突触后表达的GFRα1对DA神经元的发育有深远影响，导致成人DA神经元数量增加40%。信号转导与转录激活因子(STAT3)以前表明是被致癌基因RET激活，而不受配体和GFRα支配。Lihan等[11]研究证实NRTN诱导初级神经元和神经细胞中STAT3的丝氨酸727而不是酪氨酸705的磷酸化。值得注意的是STAT3磷酸化被发现是由特殊的媒介GFRα2c和RET9亚型所介导，此外STAT3的丝氨酸显性负性突变体破坏了NRTN诱导的神经突生长，说明了STAT3作为NRTN发挥功能的一种下游媒介。这些发现证实了特殊的GFRα2c和RET9亚型在介导NRTN激活STAT3, 以及在通过线粒体内部P-Ser-STAT3介导NRTN诱导神经突生长中还有未被认知的新作用。

1.2 蛋白分选受体(SorLA)

GDNF捆绑到它的受体GFRa1和信号，通过跨膜受体酪氨酸激酶RET或RET独立通过神经细胞黏附分子(NCAM)或多配体聚糖-3，但细胞与GDNF和它的受体间的相互作用仍然不清楚。Simon等[12]发现，SorLA作为GDNF/GFRa1复合体的排序受体，指引这个复合体从细胞表面到核内。凭借这个机制，在GFRa1再循环并建立一个高效的GDNF的清晰通路中，GDNF靶向作用到溶酶体和下级目标。SorLA/GFRa1复合体由于胞吞作用(但不是降解作用)进一步靶向RET，影响GDNF诱导的神经营养活动。SorLA缺陷小鼠显示了较高的GDNF水平，多巴胺能的功能显著改善、明显极度活跃和焦虑减少，所有这些表现都与异常的GDNF作用有关。总之，这些发现[12-13]确立了SorLA作为一个在中枢神经系统(CNS)中使GDNF起作用的关键调节器。

1.3 核受体相关因子(nurr)

目前在GDNF与其相关神经元进行PD患者神经保护的临床试验中，尽管经典神经毒动物模型对于PD有效，但GDNF还没能担负起DA神经元被突触核蛋白(SYN)毒性杀死的PD啮齿模型的保护作用。Mickael等[14]使用SYN介导的PD大鼠模型，显示过量细胞浓度的SYN有效地阻止了DA神经元对GDNF的营养应答，证明GDNF信号阻滞是由于减少转录因子Nurr1和其下游靶目标(GDNF受体Ret)的表达。缺失Nurr1导致Ret表达减少，并伴随DA神经元对于外生GDNF的应用反应完全失效。然而当研究者诱导Nurr1的表达后，Ret受体被恢复成多巴胺神经元遭受SYN毒性时对GDNF一样的反应。结果[14-15]证实Nurr1是在细胞中抵御SYN毒性的关键因素，并强调指出Nurr1可以作为一个有前景的PD神经保护疗法的新靶标。

1.4 泛素蛋白酶(UPS)系统

UPS系统的损伤是PD患者神经变性过程潜在的细胞机制，Yunlan等[16]研究显示，在研究PD的发病机制和神经保护方面,选择性蛋白酶抑制剂乳胞素在以黑质(SN)为靶标诱导的老鼠模型中被证实有效。他们使用2型腺病毒相关载体(AAV2)编码的GDNF注入到动物模型的纹状体中检测GDNF基因疗法的效果和可能机制，结果表明AAV2介导的GDNF基因疗法显著减弱了乳胞素诱导的黑质和纹状体DA神经元丢失的水平，还发现GDNF蛋白主要表达在室管膜下层区域(SVZ)和齿状回(DG)的星形胶质细胞中。提出AAV2介导的GDNF基因疗法能保护黑质DA神经元由UPS损伤介导的退化，其一部分起因于黑质DA神经在脑中再生，且可以用于治疗PD。

2 GDNF对DA神经元的影响

PD相关蛋白的基因突变: PINK1和LRRK2导致活性氧(ROS)形成前线粒体功能受损，多种通路通过这些基因突变受抑制不可避免的引起神经细胞损伤[17]，使中脑DA神经元退化引起纹状体DA不足导致PD标志性运动症状。在动物PD模型中GDNF可以改善神经退行性变和促进DA系统伴随毒性损害的修复，然而Fredrik等[18]的临床研究产生了混合的结果，GDNF在SYN高表达的基因动物模型中无效。线粒体损伤引起的DA神经元进行性退化的PD老鼠模型中，发现GDNF通过腺相关病毒或通过微渗透泵传送到纹状体，部分减轻了渐进的运动症状，但没有改善神经退行性变的比率。这些行为变化伴随着中脑DA水平的增加，但不是在纹状体中。在高位置的GDNF反而减少了纹状体的DA水平，这些结果证实了GDNF在渐进性DA系统损伤中是有潜能的疗法。Luis等[19-20]的啮齿动物模型PD中表明调节GDNF可以保护神经元，改善动物运动行为有效的调节了病态。Feng等[21]进行GDNF在6-OHDA诱导的PD细胞模型中潜在的神经保护机制的研究中，发现了17个以前未被报道过的基因，并提出GDNF在6-OHDA诱导的损害MN9D细胞的PD模型中促进了保护基因的表达、抑制了凋亡相关基因的表达,这项研究对于GDNF在DA神经元中的保护机制的研究提供许多特殊的有潜能的候选基因。胚胎干细胞(ESCs)疗法已经越来越多的认识是一种临床必需的疗法[22]，通过神经再生的过程替换或供养PD潜在的功能损害的细胞。Tian-wei等[23]移植老鼠的ESCs CGR8，CGR8稳定表达了GDNF和酪氨酸羟化酶(TH), 进入由6-OHDA 诱导的PD大鼠损伤的Str或Str-SN中拯救了大鼠的不正常行为，提出在SN-Str意义重大的功能损害至少部分由基于ESCs表达的TH和GDNF所修复，这可以成为一种治疗PD有价值的工具。Zhenhua等[24]的研究调查了猕猴自体间充质干细胞(MSCs)防护MPTP诱导损伤所表达GDNF(GDNF-MSCs)的功能。MSCs起源于猕猴体内骨髓并基因修饰后表达GDNF, 随后单侧移植GDNF-MSCs进入纹状体和黑质中，猕猴受到MPTP诱导成稳定的系统性PD状态，运动的功能不仅在接受MSCs的部位还在接受GDNF-MSCs的对侧肢体也未受到侵害，在脑桥的Str中DA水平和DA再摄取均提高。这个结果建议自体的MSCs可能是一种为提高黑质纹状体功能而传送GDNF的安全载体。Dezhi等[25]在PD大鼠模型中慢病毒介导的TH和GDNF基因工程的间充质干细胞(MSCs)的研究中，证明结合MSCs的移植表达TH和GDNF能在治疗大鼠PD模型中产生显著疗效。Ofelia等[26]的试验显示，在Str中注射GDNF增加了杂合Gdnf+/小鼠的肌肉活动的水平与野生型(WT)对照小鼠持平，且此作用可以维持整整4周。Gdnf+/小鼠运动的增加伴随着在纹状体GDNF蛋白质水平和SN GDNF增加增加40%。此外，GDNF疗法显著增加了中年Gdnf+/小鼠SN中TH阳性神经元(positive neurons)的数量，这与在SN中氧化应激的减少配合在一起。这些研究进一步支持了与黑质纹状体通路的功能障碍有关的这种长期的变化是受GDNF表达的影响，并且这种功能障碍似乎对GDNF治疗敏感。此外，这些研究说明长期的GDNF消耗改变了对GDNF治疗的生物学和行为的反应，GDNF可以部分还原在Str-SN-DA系统中年龄相关的加速衰退和运动功能，减轻SN中神经炎症和氧化应激。Agnieszka等[27]阐明PD退化在单侧黑质Str-SN中6-羟多巴胺6-hydroxydopamine (6-OHDA)损伤的大鼠中，血清2型腺相关病毒(AAV2)与GDNF的作用。通过灌入到纹状体(ST)中的载体被运送到SN), SN的致密部(SNc)和网状部(SNr)，观察在受损大脑半球的GDNF免疫反应，结果证明AAV2专门通过顺行转运到整个SN-Str。这个传输现象直接表达GDNF到整个基地神经节区域，对PD是不利影响(除SNc外)。GDNF可以保护DA神经元免受6-羟多巴胺(6-OHDA)的毒性, Ann等[28]的研究证实了此结论，GDNF防止了DA细胞的死亡和Str内DA容量的丢失，但是需要几周时间完全修复DA能的表型，这些结果提供了深刻了解GDNF保护DA神经元的机制，并帮助避免错误的解释暂时表型的改变。ANASTAS?A等[29]的研究有力地证实了GDNF在6-OHDA损伤的大鼠模型电休克(ECS)疗法中有神经保护作用。Zhang等[30]通过沿神经生长因子-1(netrin-1)和GDNF通路实现了长距离定向生长多巴胺能的轴突，这种长距离的轴突导向技术证明了在重建损伤的神经循环，即在PD中黑质纹状体通路是一种有益策略。

3 GDNF机制在治疗PD中的应用及展望

由于GDNF同源二聚体的结构使得它不适合运输通过血脑屏障(BBB), 所以由于它的尺寸使移植GDNF微粒或转染细胞进入人脑是有限的，Richardson 等[31]使用一种新的介入性的核磁共振成像(iMRI)技术在PD患者的黑质中输入GDNF,实现了GDNF在硬膜运动区广泛表达。Eduardo等[32]使用哺乳动物细胞衍生系统进行一种快速、简单的获取大量纯化人源GDNF(hGDNF)的方法，由塞姆利基森林病毒(Semliki Forest virus)诱导强大的哺乳动物细胞中宿主细胞蛋白质的合成。FLETCHER等[33]的研究目标是把hGDNF表达在大鼠Str中作为一种压缩的DNA纳米颗粒(DNP)，将hGDNF长期在生物活性水平表达来治疗PD，结果观察到在脑内注射DNA血浆编码的hGDNF长期且稳定的活性水平比基线高出了300%～400%。替米沙坦(TEL)是血管紧张素-1受体(AT1R)拮抗剂，已经有报告运用TEL的神经保护作用治疗PD的动物模型。Sekar等[34]通过研究C57BL/6J老鼠的多巴胺转运蛋白(DAT)和TH中蛋白质表达的调节，确定了TEL在1-甲基-4-苯基-1,2,3,6四氢吡啶(MPTP)诱导的运动功能障碍和DA退化中的作用，提出脑内肾素血管紧张素系统(RAS)在PD患者的运动功能和调节关键蛋白(如SYN、BDNF、TH)中起决定性作用，AT1R拮抗剂能够改善PD运动功能并可作为有潜能的神经保护药。GDNF的神经保护作用已经在各种PD毒性模型中广泛研究，然而这种神经保护作用是否能够防御易聚合蛋白SYN诱导的毒性仍然未知。Mickael等[35]的研究针对在SN-Str人类野生型SYN的过表达，使用腺病毒相关的载体在SN的DA神经元产生一种渐进性退化，并产生在Str轴突的病理过程。结果发现量化纹状体中SYN的阳性聚合物揭示了GDNF对SYN的聚集无效等一系列证据证明了在PD的体内模型中GDNF缺乏抵御人类野生型a-synuclein神经保护作用。此研究观察到PD明确的机理是与自由基的应激和线粒体的损伤(以6-OHDA和MPTP处理过的动物模型)仅仅是复杂神经病理级联反应导致神经元功能障碍和细胞死亡的一部分，未来应该使用综合性临床前模型或不同的发病机制来揭示人类疾病。目前对GDNF 的研究还限于实验室阶段，对其信号转导途径和作用机制还需要深入研究。GDNF促进癫痫后神经损伤作用已经得到很多实验的证实，GDNF治疗将是今后研究PD损伤后神经保护治疗的方向之一。如何将外源性GDNF靶向性地导入病变脑区，如何更好地调节内源性GDNF及其受体系统的表达，如何有效地调控GDNF相关的信号转导通路都是进一步要探究的内容。

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