人参皂苷Rb1对H2O2损伤RGC-5细胞的保护作用及机制探讨

李 颖，张秀丽，汪 卓

(1中国医科大学附属第一医院，沈阳110001;2滨州医学院药学系;3东北大学生命与健康学院)

青光眼是一类以视神经损伤和视野缺损为特征的眼病，已成为不可逆性致盲眼病的第二位疾病，其主要机制与视网膜神经节细胞(RGC)凋亡和神经纤维的丢失有关，因此对于RGC的保护和再生治疗成为当今眼科研究领域的新热点。人参是传统的补益中药，人参皂苷是人参中的主要有效成分。实验研究表明，人参皂苷Rb1对H2O2诱导的新生大鼠心肌细胞有保护作用［1］。2014年5～8月，我们观察了人参皂苷Rb1对H2O2损伤RGC-5细胞的保护作用，并探讨其可能机制。

1 材料与方法

1.1 试剂及仪器 H2O2、人参皂苷 Rb1、Fluo-3/AM(Molecular Probe)、Caspase-3抗体、SABC 试剂盒(武汉博士德);谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所);胎牛血清(杭州四季青生物材料工程研究所);DMEM(Gibco公司)。二氧化碳恒温培养箱，酶标仪，荧光显微镜。

1.2 细胞培养 RGC-5细胞采用10%胎牛血清的高糖DMEM/F12培养基，细胞培养于37℃、5%CO2培养箱中，每3～5 d后通过胰酶消化传代培养。

1.3 细胞活力观察 RGC-5细胞以1×105/mL接种于24孔板中培养24 h，实验分为5组，E组不制备H2O2损伤模型，也不干预;A、B、C组提前30 min加入0.05、0.1、0.2 mmol/L 人参皂苷 Rb1，A、B、C、D组均加入0.2 mmol/L H2O2诱导氧化损伤24 h，加入终浓度0.5 mg/mL的MTT，37℃孵育4 h后，加入DMSO 100 μL，采用酶标仪在490 nm处检测细胞OD值(代表细胞活力)。

1.4 细胞GSH含量、SOD活性检测 RGC-5细胞以1×105/mL接种于24孔板中培养24 h，空白对照组不制备H2O2损伤模型，也不干预;人参皂苷Rb1组提前30 min加入0.1 mmol/L人参皂苷Rb1，人参皂苷Rb1组及H2O2损伤组均加入H2O2诱导氧化损伤24 h，弃培养基，每孔加入细胞裂解液100 μL，冰上裂解30 min后，收集上清液并离心，按照GSH含量测试盒说明书设置空白孔、标准孔和测定孔，分别加入不同试剂混匀，静置5 min，在405 nm处，采用酶标仪测定各孔的吸光度值。按照SOD活性测试盒说明书分别设置对照孔、对照空白孔和测定孔，三孔分别加入不同试剂混匀，37℃孵育20 min，450 nm处酶标仪测定各孔的吸光度值。

1.5 细胞Caspase-3蛋白检测 分组及各组干预(方法同1.4)后，弃培养基，PBS洗涤3次后，4%的多聚甲醛固定室温10 min，弃固定液后PBS洗涤3次，0.5%Triton-100室温穿孔5 min，PBS洗涤3次，1%BSA室温封闭30 min，加入1∶500的 Caspase-3一抗，于37℃孵育2 h，PBS洗涤3次，按照 SABC说明书加入二抗及荧光试剂，同时加入4＇，6-二脒基-2-苯基吲哚，荧光显微镜下观察Caspase-3免疫反应阳性细胞，并计数，计算免疫反应阳性细胞百分率(阳性细胞百分率 =阳性细胞数/总细胞数 ×100%)。

1.6 细胞 Ca2+检测 分组及各组干预(方法同1.4)后，弃培养基，PBS洗涤3次后，各组细胞用5 μmol/L Ca2+荧光探针Fluo-3在37℃孵育1 h后，荧光显微镜下观察Ca2+荧光强度，并计算阳性细胞百分率(阳性细胞百分率=阳性细胞数/总细胞数×100%)。

1.7 碘化丙啶(PI)染色细胞检测 分组及各组干预(方法同1.4)后，弃培养基，PBS洗涤3次后，加入终浓度为0.05 mg/mL的PI，室温染色15 min，荧光显微镜下观察红色荧光的细胞，并计算阳性细胞百分率(阳性细胞百分率=阳性细胞数/总细胞数×100%)。

1.8 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件。计量资料以±s表示，组间比较采用方差分析。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组细胞活力比较 A、B、C、D、E组在490 nm处OD 值分别为 0.266 ±0.038、0.299 ±0.025、0.314 ±0.014、0.222 ±0.031、0.391 ±0.041，A、B、C、E 组与 D 组比较，P 均 ＜0.05。

2.2 各组细胞SOD活性、GSH含量比较 空白对照组、人参皂苷Rb1组、H2O2损伤组SOD活性分别为(19.88 ±0.12)、(17.12 ±0.32)、(15.47 ±0.21)U/mgprot，人参皂苷 Rb1组、空白对照组分别与H2O2损伤组比较，P均＜0.05。空白对照组、人参皂苷Rb1组、H2O2损伤组GSH含量分别为(15.67±0.18)、(14.98 ± 0.25)、(13.71 ± 0.31)μmol/gprot，人参皂苷Rb1组、空白对照组分别与H2O2损伤组比较，P 均 ＜0.05。

2.3 各组细胞Caspase-3蛋白比较 空白对照组、人参皂苷Rb1组、H2O2损伤组Caspase-3阳性率分别为 12% ±0.25%、57% ±0.47%、28% ±0.18%，人参皂苷Rb1组与H2O2损伤组比较，P＜0.05。

2.4 各组细胞PI染色阳性率比较 空白对照组、人参皂苷Rb1组、H2O2损伤组细胞染色阳性率分别为16% ±0.25%、18% ±0.45%、32% ±0.56%，人参皂苷Rb1组与H2O2损伤组比较，P＜0.05。

2.5 各组细胞Ca2+水平比较 空白对照组、人参皂苷Rb1组、H2O2损伤组细胞Ca2+荧光染色阳性率分别为 8% ±0.11%，31% ±1.20%，19% ±0.34%，人参皂苷Rb1组与H2O2损伤组比较，P＜0.05。

3 讨论

目前认为，青光眼致视功能损害的共同病理基础是神经节细胞的进行性死亡和神经纤维丢失，导致不可逆性视神经萎缩和视野改变，构成青光眼的最终改变，氧化应激引起的RGC凋亡是重要原因之一［2］。研究［3，4］表明，氧化应激可以诱导体外 RGC细胞Casepase依赖性的凋亡。H2O2是有机体氧化代谢产物，是一种活性氧，能直接氧化细胞膜上的脂质及蛋白，能自由穿过细胞膜细胞内离子反应生成活性更强的自由基，H2O2在体外能诱导ROS产生和细胞凋亡，因此被广泛用于各种急性和(或)慢性氧化损伤模型［5，6］。

人参是一种传统的药物，人参皂苷Rb1是近年来研究较多的一类人参单体，其具有抗衰老、抗氧化、提高免疫力和增强记忆力等功效［7，8］。研究［9，10］表明，人参皂苷 Rb1 可明显减少 Aβ25-35 诱导的神经细胞凋亡，对神经细胞的缺血性损伤有保护作用。由于H2O2在体外能诱导ROS产生，当机体内H2O2增多或者清除能力减弱时，就会产生氧化应激损伤。本研究显示，随着H2O2浓度的增高，细胞的存活率降低，当H2O2浓度为0.2 mmol/L时细胞活力最大。通过人参皂苷Rb1干预后，细胞活力明显提高，提示人参皂苷Rb1对氧化损伤具有保护作用。

机体内存在抗氧化系统包括酶系统和非酶系统，SOD是抗氧化酶系统的重要组成部分，通过歧化的方式清除超氧自由基，而GSH是体内重要的抗氧化剂和自由基清除剂［11］。因此，检测SOD活性和GSH含量可反映机体的过氧化程度。本研究显示，人参皂苷Rb1组SOD活性、GSH含量较空白对照组降低，较H2O2损伤组升高，提示这个可能是人参皂苷Rb1的保护机制之一。ROS可氧化细胞膜上的脂质，脂质的过氧化物进而引起细胞内的Ca2+失衡［12，13］。细胞内钙超载在细胞凋亡的过程中起关键作用。钙超载及其所触发的一系列有害代谢是导致神经细胞死亡的“最后共同通路”细胞内钙超载可使一些参与细胞凋亡的Ca2+依赖性蛋白酶激活，导致生物膜损伤［14］。本研究显示，人参皂苷Rb1组Ca2+水平较空白对照组降低，较H2O2损伤组升高，提示人参皂苷Rb1可能是通过细胞Ca2+的调节对H2O2损伤RGC-5起保护作用。本实验采用PI染色观察H2O2是否诱导细胞凋亡，因为PI不能穿过活细胞的细胞膜，而对坏死的细胞由于细胞膜的完整丧失而被着色。本实验结果显示，当H2O2作用RGC-5细胞后，PI染色的细胞明显增多，说明H2O2对RGC-5细胞具有明显的损伤作用，加入人参皂苷Rb1干预后PI染色的细胞明显减少，说明人参皂苷Rb1具有抗凋亡的作用。凋亡是一种受基因调控的程序性死亡，Caspase是天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白水解酶是细胞凋亡过程中最关键的蛋白酶家族，通常以无活性的酶原形式存在［15］。Caspase-3是Caspase家族中最为重要的凋亡执行者之一［16］，是最关键的凋亡蛋白酶，当被活化后，酶解、切割特异性底物如DNA依赖性蛋白激酶等，改变其结构或影响特定信号分子而引起细胞凋亡［17］。研究［18，19］表明，高浓度 H2O2能使 Caspase-3 活化，进而导致细胞凋亡。本研究显示，H2O2诱导损伤RGC-5细胞后，Caspase-3阳性细胞表达率明显增多，而人参皂苷Rb1能抑制Caspase-3阳性表达率，提示人参皂苷Rb1通过减低Caspase-3的活化进而抑制H2O2诱导RGC-5细胞的凋亡。

总之，人参皂苷Rb1能够拮抗H2O2对RGC-5细胞的氧化损伤，其机制可能为提高SOD活性和GSH含量，降低Caspase-3的表达，减少Ca2+水平。

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