Hippo通路、Yes相关蛋白及其与肿瘤关系的研究进展

苏莉莉，苏稼航，马卫霞，王 雯

(1山东大学附属省立医院，济南250021;2烟台市中医医院)

Hippo通路是近年来新发现的一条细胞信号传导通路，可通过调节细胞增殖和凋亡平衡调控器官体积、调节细胞间的接触性抑制［1］，该通路调控异常可导致人体多种疾病的发生。Yes相关蛋白(YAP)由Sudol等［2］于1994年首先报道，其因相对分子质量约65 kDa又被称为YAP65。研究证实，YAP是Hippo通路的核心效应因子，是一种多功能的细胞内连接蛋白和转录共激活因子，在正常机体细胞内发挥信号转导和基因转录调节的作用。现将Hippo通路、YAP及与肿瘤关系的研究进展综述如下。

1 Hippo通路的组成和下游效应因子

1.1 Hippo通路的组成 研究发现，尽管外部环境中的营养、激素等因素发挥了重要作用，但是在外部条件不变的情况下，器官发育或修复到一定时机仍然会停止进一步生长。因此，Bullough［3］早在1971年就提出了“抑素”学说，认为机体内存在一种能对生长发育起负反馈调节的“抑素”，可以自主控制器官的大小。由于一直没有实验室证据能证实“抑素”的存在，“抑素”假说一直未被引起重视。直到Hippo通路在果蝇体内首次被发现，才为人们研究这一现象提供了重要的切入点［2］。Hippo通路主要包括四个组成部分:Warts(Wts，又称为Lats)、Hpo、Salvador(Sav，又称为 shar-pei)和 Mats，可通过下调果蝇凋亡抑制蛋白1(DIAP1)、Bantam、细胞周期调节因子(CycE)等的表达维持细胞增殖和凋亡平衡。Wts是Hippo通路中最早被分离出来的基因，其编码的蛋白包括一个激酶家族，即Nuclear Dbf2-related(NDR)蛋白家族［4］。研究发现，Wts的缺失会导致动物的翼、腿、眼睛等多种上皮组织细胞出现不受抑制的过度增殖现象，但是细胞分化不受影响。

在2002年Sav基因被发现之前，由于一直没有发现Wts的上游调节因子、结合配体和下游效应因子，Wts曾经被认为是孤立的肿瘤抑制蛋白。Sav编码含有一个WW结构域的蛋白，具有与Wts相似但稍微弱的功能。Tapon等［5］首次发现Wts或Sav缺失会导致细胞过度增殖和凋亡受抑制，但不影响细胞分化，从而证实两者可协同双向调节细胞的生命活动;他们还发现Wts或者Sav缺失会引起CycE和DIAP1含量增加，推测CycE和DIAP1是Wts或者Sav的靶因子，但作用机制尚未被阐明。在对Hippo通路的研究中，第三个重要进展是2003年Wu等［6］对Hpo肿瘤抑制基因的发现和阐明。Hpo编码Ste-20蛋白激酶家族，具有与Wts、Sav相似的功能。Wu等［6］发现，Hpo激酶级联系统中存在Hpo磷酸化和Wts激活(而Sav可保证并促进该磷酸化反应的发生)，还在转录水平上调控DIAP1的表达。但是，也有学者［5，7］认为对 DIAP1的调控发生在转录后，是通过磷酸化进行调控的。Mob1家族是一组有调节功能的小相对分子质量蛋白质，能增强Wts的肿瘤抑制功能［8］。Lai等［9］证实在果蝇体内存在一种Mob1相关蛋白即Mats，后者可与Wts接合并激活Wts的激酶活性。Mats缺失后引起的细胞过度增殖现象与前述的Hpo、Sav、Wts研究相似，进一步证实Mats也是Hippo通路中的成分之一。

1.2 Hippo通路的下游效应因子 CycE和DIAP1是Hippo通路的下游转录效应因子，但 Neufeld等［10］发现，CycE过度表达时虽然细胞凋亡受到抑制，但并未引起组织器官过度生长，提示还有其他下游转录效应因子共同参与了Hippo通路中的转录调控。Brennedke等［11］发现，Bantam 具有与 Hippo通路中其他成分相似的性质，参与细胞增殖和凋亡调控。另有学者［12，13］发现，Yki过度表达能上调 Bantam表达;Bantam缺失能部分抑制Yorkie(Yki)诱导的细胞过度增殖，而Bantam过度表达则可减少Yki突变对细胞增殖的影响。可见，Bantam与CycE和DIAP1发挥相似的生物学功能，三者共为Hippo通路中的主要效应因子。总之，无论是Ste-20家族蛋白激酶Hpo还是NDR激酶Wts，每一个激酶系统都有专门的相关调节因子，比如Sav对Hpo、Mats对Wts。这些激酶级联系统对靶因子(比如Bantam、CcycE和DIAP1)起负相调节作用，进而调控细胞增殖和凋亡平衡。

2 YAP的发现背景及其调控作用

2.1 发现背景 在Hpo激酶级联调节DIAP1的转录过程中，应有转录调节因子存在以控制DIAP1的转录和活性，并且调节因子自身也被Wts激酶的活性所调节。Huang等［14］通过酵母双杂交法证实了这一转录共激活因子的存在，即Yki。通过伯克利果蝇基因组计划，Huang等利用Wts基因非催化N端第1到第608对碱基作为“饵”，从100多万个cDNA克隆中分离出了三个独立的克隆，后者代表一个含有CG4005序列部分的基因，这个基因被命名为Yki。利用酵母双杂交法，Huang等还发现Yki和Wts共同免疫沉淀于果蝇S2细胞内。

Yki的生物化学和遗传学特性证实其完全具备作为Wts下游效应因子调控细胞生长的所有预期功能。Yki可被Wts磷酸化而失活。Yki过度表达与Wts失活引起的现象一致，比如DIAP1的转录增加、细胞过度增殖等;相反，Yki缺失会引起组织发育萎缩。与Hippo通路中其他肿瘤抑制因子性质相似，Yki缺失或活化均不影响细胞的分化程度。基因分析表明，Yki存在于 Sav、Hpo、Mats、Wts 的下游。在研究Hippo信号通路过程中，Yki的分离有重要意义，其存在证实Wu等［6］的观点是正确的，即Hpo激酶级联调控靶基因是在转录水平而非转录后进行的。Huang等还证实人类体内YAP与果蝇Yki的同源性高达31%，都含有两个WW域，后者含有35～40个氨基酸的蛋白质—蛋白质相互作用模块，可与含有PPXY的多肽链相互作用。除了WW域之外，YAP与Yki在蛋白质分子的N端延伸序列上也相似。因此，人类的YAP基因与果蝇的Yki高度同源，在进化过程中高度保守。

2.2 调控作用

2.2.1 导致细胞过度增殖、凋亡受抑(但不影响细胞分化) Pignoni等［15］在不同培养皿中培养不同克隆的成年果蝇翼上皮细胞，结果发现Yki过度表达克隆的翼面积是正常者的8倍，且细胞生长出现“顶端肥大”现象，即上皮细胞在一端形成“圆屋顶”状。Wu等［6］发现Hpo和Wts突变时也会出现上述现象，提示Yki、Hpo和Wts在同一条通路中发挥作用。Huang等［14］发现Yki过度增殖组和对照组(普通果蝇成虫的翼细胞)的细胞倍增时间分别为12、16.1 h，而Wts发生突变时亦会出现细胞倍增时间缩短现象。FACS分析显示Yki过度增殖细胞株的细胞周期和细胞大小与野生株相似，与Hpo基因缺失导致的现象相同。Wolff等［16］发现果蝇成虫眼的假复层上皮细胞以相同的方式分化、增殖、凋亡。Huang等［14］发现果蝇成虫眼的感光细胞分化不受Yki过度增殖的影响，此与Hpo基因缺失引起的改变相似;过度表达Yki的果蝇蛹视网膜细胞凋亡减少。

2.2.2 增加CycE和DIAP1转录 为进一步证实Yki在 Hippo 通路中的作用，Huang等［14］检测了Hippo通路的下游效应因子CycE和DIAP1，发现Yki过度表达时DIAP1含量增加，并且是在转录水平上发生的。Jones等［17］在相似的实验中发现CycE含量也是增加的。但Huang等［14］报道 CycE含量增加见于Hpo、Sav或Wts基因缺失，而DIAP1含量增加仅见于Hpo基因缺失，认为DIAP1是Hippo通路更直接的转录效应因子。Huang等利用“同源重组”技术发现，Yki基因完全去除形成空等位基因后突变纯合子在胚胎发育晚期或者幼虫早期即死亡，而将Yki基因完全植入后动物可存活并发育成表型正常的成虫;Yki缺失时DIAP1含量随之下降。

2.2.3 其他调节作用 哺乳动物和人类的YAP基因位于染色体11q22上，而YAP蛋白则在机体各组织中广泛表达［18］。Huang等将 Yki基因与酵母Gal4转录因子的DNA结合域相结合后发现Gal4DB-Yki融合蛋白具有潜在的转录活性，而Hpo、Sav和Wts基因共表达时 Gal4DB-Yki融合蛋白的转录活性消失，推测此现象与影响Yki活性有关(上述三基因共表达对Gal4无影响)，证实Hippo通路对Yki的含量呈负向调节作用。进一步研究发现，Yki活性与Hippo通路之间存在剂量相关，且在Hippo通路中Yki是被Wts磷酸化而激活的。c-Jun在DNA受损伤后细胞反应中发挥重要作用，细胞发生辐射损伤时c-Jun被快速诱导产生并且阻止p53介导的p21上调;p53介导的G1期阻滞需要c-Jun进入细胞周期再循环，作用是使细胞对p53介导的凋亡产生抵制。在顺铂所致DNA损伤(化疗敏感性)中c-Jun也发挥重要作用。细胞对化疗药物的反应还依赖于功能p73基因的活性，利用RNA沉默技术降低肿瘤细胞内p73蛋白水平时，细胞对顺铂、喜树碱、阿霉素等诱导的凋亡反应也降低。而p73基因的活性依赖于YAP存在，p73、YAP下调时顺铂介导的细胞凋亡受到抑制。多位学者［19，20］发现，在c-Jun介导顺铂诱导细胞凋亡过程中，YAP发挥重要的下游效应因子作用，通过竞争性抑制E3泛素蛋白连接酶结合位点稳定p73蛋白的功能。YAP通过两条途径控制p73的功能，一是通过竞争性抑制调控p73蛋白水平，二是通过促进p73的转录潜力增强p73基因的功能、促进细胞凋亡［21］。因此，YAP有可能是预示化疗敏感性和预后的关键因子。

3 Hippo通路、YAP与肿瘤的关系

Hippo通路最初曾被认为是肿瘤抑制通路，其中研究最透彻的人类抑癌基因是神经纤维瘤抑制基因NF2(Mer)，NF2发挥功能主要通过调控YAP基因实现。NF2位于人类染色体22q，编码蛋白通过质膜表面蛋白与骨架成分相连;突变的NF2与2型神经纤维瘤发病相关［22］。Striedinger 等［23］发现NF2缺失会引起脑膜瘤细胞YAP过度表达，细胞失去接触性抑制的特性而过度增殖;利用RNA沉默技术敲除NF2缺失的脑膜瘤细胞株的YAP基因后，细胞增殖停滞于S期，提示NF2缺失会增强YAP的致癌功能。Yokoyama等［24］利用基因组技术分析了恶性胸膜间皮瘤细胞，发现位于染色体11q22的YAP表达增强;敲除NF2缺失的间皮瘤细胞NCI-H290的YAP基因后细胞增殖受抑、反之细胞增殖过度，将缺失的NF2基因重新植入NCI-H290细胞系会使YAP在Ser127位点磷酸化而失活。

Mst1和Mst2基因参与调控组织器官大小，两者缺失可导致YAP在S127位点失去磷酸化而激活［25］，而将小鼠的Mst1和Mst2基因敲除后其肝细胞过度增殖并癌变［26，27］，转基因YAP过度表达可引起肝细胞过度增殖和癌变［28］。Zender等发现在鼠肝癌模型诱发祖细胞恶变过程中，染色体9qA1(人类染色体11q22)区域有两个片段经常性放大，是候选的致癌基因(YAP为其中之一)。Liu等［29］发现YAP在肝癌中高表达，且与患者血清AFP含量、肝癌细胞的分化程度相关，是肝癌患者总生存率和无病生存率的一个独立预后指标。Overholtzer等发现乳腺癌MCF10A上皮细胞中YAP过表达会诱导细胞出现上皮—间质转化(EMT)、凋亡受抑、不依赖于生长因子增殖、非停泊性生长等现象。而Zhang等［30］发现YAP能增强卵巢癌细胞株的转化表型及降低卵巢癌细胞对化疗药物的敏感性，YAP高表达的患者预后不良。Dong等［31］发现YAP在肿瘤细胞中存在两种不同的分布方式，一种是突出的细胞核浓聚，另一种是细胞质和细胞核染色、无细胞核浓聚。Steinhardt等［32］检测了 YAP在结肠腺癌、肺腺癌、卵巢浆液性囊腺癌、乳腺导管癌等四种常见实体瘤中的表达，发现前三种肿瘤组织中表达均呈阳性，而相应的正常组织则呈阴性或灶性表达。推测YAP可能作为致癌因子参与了肿瘤的发生和发展。

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