用血清游离轻链分析法检测单克隆Y-病

王继贵

(中南大学湘雅二医院,湖南长沙410011)

.述评.

用血清游离轻链分析法检测单克隆Y-病

王继贵

(中南大学湘雅二医院,湖南长沙410011)

单克隆免疫球蛋白游离轻链,对单克隆γ-病是一种重要的诊断标志物.150多年来一直沿用尿加热试验检查Bence-Jones蛋白,以及用血清蛋白电泳及尿蛋白电泳检查M蛋白区带,诊断单克隆γ-病.这些方法敏感度低,特异性差,远远不能满足该病诊断和分类的要求.近十年来,发展了血清游离轻链的自动化免疫试验,能独立地测定κ链、λ链、κ/λ比率和游离轻链总量,大大地提高了单克隆γ-病的诊断、分类和治疗监测.本综述将讨论用于测定游离轻链的不同实验方法,并介绍临床应用的评价.

游离轻链;单克隆γ-病;多发性骨髓瘤

单克隆免疫球蛋白游离轻链(Free light chains, FLC)对单克隆γ-病(Monoclonal gammopathies,MG)是一个重要的诊断标志物.150多年来,尿中出现本一周氏蛋白(Bence-Jones protein,BJP)已用作单克隆FLC产生的关键指征.然而,最近10年,随着可利用的自动化免疫试验的发展,独立地测定血清κ和λ FLC,大大地促进了MG的诊断和治疗监测.血清FLCs(serum free light chains,sFLCs),通过肾小球迅速被清除,半衰期为2~6h.sFLCs浓度是一个更准确的代表产生的水平,当多克隆免疫球蛋白产生增加和/或肾损伤时,κ和λ sFLC两者的浓度可增加30~40倍,然而,κ与λ的相对浓度(即κ/λ比率)保持不变,或仅轻微地增加.相反,在浆细胞恶液质(Plasma cell dyscrasias,PCD)的病人中,一种FLC型的单克隆产生过量,出现一种异常的κ/λ比率,提供一种克隆形成能力的数学指征.对于单克隆γ-病,sFLC试验对于诊断、预后及监测这类病人的临床重要性,现在已完全确定,在国际指南中[1,2]已得到公认.

1 测定单克隆FLC的方法

过筛MG的实验室方法,传统上是用血清蛋白电泳(Serum protein electrophoresis,SPE)和尿蛋白电泳(Urine protein electrophoresis,UPE).单克隆蛋白(M-蛋白)在电泳凝胶上移动成为一条不相关联的区带,在光密度计上扫描时出现一个单一的峰,它对M-蛋白的量提供一个半定量数值.继用SPE鉴定M-蛋白之后,需用血清免疫固定电泳(Serum immunofixation electrophoresis,sIFE)以证实克隆形成能力和随后的分型.SPE的主要缺点是敏感度低,不能检测低水平的单克隆蛋白,sIFE更敏感,大约比SPE敏感10倍[3].可以测定用SPE检测不出的单克隆蛋白.然而,寡分泌病(Oligosecretory diseases)病人,如轻链多发性骨髓瘤(light chain multiple myeloma,LCMM)、AL-淀粉样变性和轻链沉积病(light chain deposition disease,LCDD),这类病人单克隆FLCs水平,用SPE或sIFE常常不足以检出.在150多年期间,尿中单克隆FLCs(BJP)对于多发性骨髓瘤(MM)已是一个重要的诊断标志物, UPE和尿IFE(uIFE)对于检测单克隆FLCs比SPE更敏感,可检测尿中水平低于20mg/L的FLCs.尽管UPE和uIFE比SPE敏感,前两个方法仍然有它们的技术和实用性限制[3].首先,血清中FLC水平必须显著增加,尿中方可出现BJP,血清中低水平的单克隆FLC,尿中可能检不出,尿BJP试验不能直接反映基础的单克隆FLC的产生率;第二,尿分析需收集24h尿标本,成批检查,不能用随机尿,随机尿的变动性在5%~59%之间,因此延迟了报告结果的时间,第三个可能的限制是基于尿测定鉴别单克隆FLCs是主观的解释电泳结果,检测低水平的单克隆FLCs是特别困难的.由于尿分析的突出限制,国际指南[2]现在推荐在诊断MG时用血清FLC试验代替尿分析.

1.1 用于血清单克隆FLC检查的免疫试验在2001年,自动化的sFLC免疫试验(Freelite,Binding Site,UK)使能在常规的实验室中进行血清单克隆FLC的定量测定.sFLC免疫试验提供一种独立地测定κ和λ FLC,且可计算κ/λ sFLC比率,提供一个克隆形成能力的敏感的数学指征.在浆细胞恶液质(Plasma cell dyscrasias)的病人中,由于频繁地骨髓交替抑制FLC,导致仅一型FLC过量产生,常常出现高度异常的κ/λ比率.这个试验是乳胶增强免疫试验,可测定低浓度的FLC,对κ和λ FLCs分别为1.5mg/L和3mg/L,远低于正常血清浓度.

Katzmann等[4]用自动化的免疫试验测定了游离κ和游离λ免疫球蛋白轻链血清参考区间,样本来自21~90岁健康人.FLC κ/λ比率参考区间为:0.26~1.65.FLC95%参考区间分别为:κ FLC是3.3~19.4 mg/L,λ FLC为5.7~26.3mg/L.研究认为用比浊法定量测定单克隆FLC比IFE更敏感,可补充IFE的不足,且能在轻链病人中定量测定FLCs,这些病人血清或尿中没有可检出的M-蛋白.

sFLC免疫试验使用的抗体有高度的特异性和亲和力,用于检测同类抗原的试验,单克隆抗体(MAbs)是很成功的.然而,一种可靠地检测整个范围的单克隆FLC受到限制,由于FLC分子的异质性,一种Mab将只能识别单一的抗原决定基,个别的Mabs将不能检测由单克隆γ-病病人产生的不同范围的单克隆FLC,因此,Freelite试验是用来自于绵羊的多克隆抗体发展的,这类试验能识别各种FLC抗原决定基,包括由单克隆γ-病病人产生的不同病理变化的单克隆FLC.

已发展了几个基于Mab的FLC免疫试验, Campbell等[5]设计了一个高敏免疫试验,用单克隆抗体同时测定血清和尿中κ和λ免疫球蛋白轻链.用特异的鼠抗人FLC单克隆抗体(MAbs),抗κ和抗λ FLC mabs分别共价结合到聚苯乙烯小珠上用于试验,方法灵敏,敏感度<1mg/L;特异,mabs显示没有交叉反应,线性范围宽,可达437.5mg/L;且可防止抗原过剩的影响.在高水平的FLC时,本法与FreeliteTM良好地相关,对于健康人群FLC标本, MAbs试验能识别血清中所有单克隆FLC.需要进一步的临床研究,以证实在不同的单克隆疾病时的实用效力.

Velthuis等[6]设计了一个N乳胶FLC新的单克隆高效试验,用于测定游离轻链κ和λ.此试验基于用单克隆抗体乳胶增强免疫比浊法测定血清或EDTA抗凝血浆及肝素锂血浆中FLC κ和λ.用于Siemens BNTM方法系统.从369例健康人标本中测定了FLC参考范围,FLCκ轻链为6.7~22.4mg/ L,FLC λ轻链为8.3~27mg/L,κ/λ比率为0.3~1.56.批间精密度良好,在4%和7%之间变动.同FreeliteTM方法比较,相关良好,对于FLC κ、λ和κ/ λ比率相关系数r分别为0.94、0.77和0.73.一致性率分别为99.2%、94.2%和95%.研究认为:N乳胶FLC试验精密度良好,不受Hook效应的影响,与FreeliteTM法有良好的一致性.需要进一步地研究以揭示新的FLC试验的临床价值.

Lock等[7]采用多中心研究比较了上述两类技术(Freelite Binding Site,UK和N乳胶FLC试验, Siemens系统)测定游离轻链的性能,在四个常规实验室,按照制造商的指令,对这两种试剂合进行了比较.采用313例血清标本比较游离κ链,324例血清标本比较游离λ链.结果发现,两法相关不好者,κ链有81%,λ链有74%.有5%的样本在这些实验中显著地不一致.研究认为:这些实验在临床实践中结果很不相同,不能互换,特别是对治疗反应的监测,需作大量的临床研究,以证实它们的临床价值.

1.2 在诊断时对sFLC试验结果的解释对于sFLC分析,应测定κ和λ两种FLCs,再计算κ/λ比率.若结果处于已发表的参考范围[4]之外时,结果应考虑为异常.再结合血清SPE和IFE测定结果及临床信息,即不难作出诊断[8].如果血清κ FLC,λ FLC和κ/λ比率都在正常范围内,且血清SPE也是正常的,此病人不可能有MG.相反,异常的κ/λ比率和κ或λ FLC一起增加,则支持MG的诊断,需要进一步地研究.临界结果需小心地解释,临界异常的κ/λ比率偶尔见于多克隆FLC增加的病人如肾损伤,多克隆高γ-球蛋白血症及感染和炎性疾病的病人[9].

2 FLC列入实验诊断方法用于诊断MG

许多研究[3,8,9]都已证实sFLC试验对于广谱单克隆浆细胞病的诊断价值,包括自无症状的未明确意义的单克隆γ-病(monoclonal gammopathy of undetermined significance,MGUS)和郁结性多发性骨髓瘤(Smouldering multiple myeloma,SMM)到有症状的疾病:多发性骨髓瘤(MM)、巨球蛋白血症(WM)、AL淀粉样变性、LCDD、孤立性浆细胞瘤(Solitary plasmacytoma)和POEMS (polyneuropathy,organomegaly,endocrinopathy,M protein and Skin,POEMS,多神经病、器官巨大症、内分泌病、M蛋白和皮肤病变综合征).许多研究都评价了用sFLC试验与其他实验室检查一起作为最初诊断的一部分,过筛疑有MG的病人.

Katzmann等[10]领导的专题小组最广泛的研究了1877例疑有MG病人的过筛.该研究组采用SPE、UPE、sIFE、uIFE和sFLC 5种技术用于过筛,在30天诊断时间内全部病人均得出结果.当SPE和sFLC联合时,有58例病人为阴性过筛(其中44例为MGUS、7例POEMS、5例AL淀粉样变性、1例浆细胞瘤和1例SMM).然而,所有的MM、WM和LCDD病人都被检出.而且,增加sFLC试验鉴别出30例病人(23例AL淀粉样变性、6例MM和1例LCDD),这30例病人用传统的一组血清和尿试验都未检查出.

基于已发表的资料,国际骨髓瘤工作组[2]结论:在有关疾病存在的背景下,过筛MM,对于诊断除AL淀粉样变性外,sFLC试验和SPE及sIFE联合,产生很高的敏感度,不需要24h尿研究.

3 sFLC试验对于MG的诊断敏感度

sFLC κ/λ比率频繁地异常可预期病人有MM包括LCMM、非分泌型MM(nonsecretory MM,NSMM)和完整免疫球蛋白MM(intact immunoglobulin MM,IIMM)以及AL淀粉样变性.

3.1 轻链多发性骨髓瘤LCMM占所有MM病例约20%,用血清或尿中出现FLCs进行诊断.在缺乏完整的单克隆免疫球蛋白时,仅用SPE过筛, LCMM病例超过40%不能检出[11],可能同没有检测尿中单克隆FLC有关.

3.2 非分泌型多发性骨髓瘤NSMM占所有MM病例的1%~5%,其特征是用IFE检查血清和尿中缺乏单克隆蛋白.然而,某些NSMM病人产生单克隆免疫球蛋白,虽然在血清中不能检出,在骨髓浆细胞中用免疫组化法可以检出.仅有10%~15% NSMM病人是真正的非分泌型,它们之中浆细胞的肿瘤细胞不含可检出的免疫球蛋白.

Middela等[12]报告NSMM在诊断上有许多困难,测定sFLC在诊断许多NSMM病人时,对病人已产生了明显的益处,避免了延误诊断.因此, sFLC免疫试验被国际骨髓工作组(International Myeloma Workshop Group,IMWG)推荐用于SNMM的诊断[2].

3.3 完整免疫球蛋白多发性骨髓瘤IIMM占所有MM病例约80%,其特征是此型MM分泌单克隆完整的免疫球蛋白,在诊断这型病人时,约95%IIMM病人也分泌单克隆FLCs,sFLC分析用于疾病的监测和预后.因FLCs血清半衰期短,使得它们成为克隆病的有用标志物,监测单克隆sFLC水平比完整免疫球蛋白水平能提供更准确地评价治疗反应,因后者半衰期较长.

重要的是IIMM病人疾病再度恶化时的血清学诊断不能仅依赖于测定单克隆完整的免疫球蛋白,在MM时对克隆演变的认识正在不断增加,且同还在产生的单克隆蛋白的变化有关.例如,IIMM病人在诊断时可能是再度恶化,可能仅产生单克隆FLCs[13].由于高浓度FLC,使病人倾向于发生肾并发症,在病人监测期间,定期评价sFLCs,能提供早期肾损害的指征和肾衰竭的任何危险性.根据涉及在MM中复杂的克隆动力学,最好同时测定单克隆完整的免疫球蛋白和sFLCs.

3.4 AL淀粉样变性和轻链沉积病AL淀粉样变性和LCDD是单克隆轻链在细胞外沉淀所引起的两种疾病.它使多器官的结构和功能紊乱.在AL淀粉样变性时,轻链片段最普通的是λ型,以不溶性淀粉原纤维聚积,常常影响肾脏和心脏.最常参与LCDD中的单克隆轻链是κ型,且沉淀在肾脏和各种其他器官细胞的基底膜上.

Palladini等[14]报告:在诊断AL淀粉样变性时,需要联合血清游离轻链试验和血清及尿IFE.用组织活检和免疫组化证实淀粉体沉淀在组织.结果显示,联合血清和尿IFE同血清FLC试验和κ/λ比率诊断敏感度为100%,认为鉴别促淀粉样变轻链,不能仅依赖单一的试验,需要联合FLC试验和血清及尿IFE.

Nasr等[15]报告了64例肾单克隆免疫球蛋沉积病(monoclonal immunoglobulin deposition disease, MIDD),其中51例为LCDD,7例为重链沉积病,6例为轻链和重链沉积病.实验室检查62例病人血清蛋白异常,47例SPE检出M-蛋白(73%),51例病人游离轻链比率异常.临床表现有肾机能不全、蛋白尿、血尿和高血压.研究显示:与轻链淀粉样变性和轻链管型肾病比较,MIDD病人通常比较年轻,23例病人≤50岁(36%).

IMWG指南[2]中推荐用sFLC分析同sIFE和uIFE联合测定过筛AL淀粉样变性和LCDD.

4 血清FLC用于早期检测骨髓瘤肾病

在MM病人中,骨髓瘤肾病是严重的、不可逆的肾衰竭的重要原因.单克隆FLCs能引起许多肾内不同的病理改变,它依次能导致不同的临床表现,其中最常见的是急性肾损伤(acute kidney injury,AKI),肾小管间质损害是高浓度的循环单克隆FLCs的直接后果.续发于肾小管间质损害的病理性管型肾病,是在肾单位内的远曲小管中形成蜡样管型,由于FLC同Tamm-Horsfall蛋白聚集引起间质炎症和纤维化,在大约90%依赖透析的MM病人中都可发现、早期诊断是十分重要的,可积极治疗以使迅速降低MM肾病病人血中的FLC浓度,改善病人的生存质量[16].因此,早期过筛测定FLC,使能迅速诊断骨髓瘤肾病,确定AKI的原因,最近,已被国际肾病和MG研究组推荐[17].

5 展望

过去150多年期间,尿中出现BJP蛋白已用作单克隆FLC产生的关键指征,用来诊断MM,然而,最近10年,随着自动化FLC免疫试验的发展,独立地测定血清κ和λ FLC,大大地促进了MG的诊断和治疗监测.

IMWG推荐血清FLC分析用于MM及有关疾病的诊断和分型,特别是由于AL淀粉样变性、LCMM和NSMM的诊断和鉴别,受到广泛的关注.最近,国际肾病和MG研究组推荐用血清FLC试验快速诊断骨髓瘤肾病过筛AKI,收到良好的效果.

血清FLC免疫试验目前有两个试验系统,一是用FLC多克隆抗体的Freelite法,另一个是用FLC单克隆抗体的Siemes系统,两个方法测定结果不完全一致,需要大量的临床研究以评价它们的临床价值.

[1]Dimopoulos M,Kyle R,Fermand JP,et al.Consensus recommendations for standard investigative workup:report of the International Myeloma Workshop Consensus Panel 3[J].Blood,2011,117(18): 4701-4705.

[2]Dispenzieri A,Kyle R,Merlini G,et al.International Myeloma Working Group guidelines for serum free light chain analysis in multiple myeloma and related disordes[J].Leukemia,2009,23(2): 215-224.

[3]Holding S,Spradbery D,Hoole R,et al.Use of serum free light chain analysis and urine protein electrophoresis for detection of monoclonal gammopathies[J].Clin Chem Lab Med 2011,49(1):83-88.

[4]Katzmann JA,Clark RJ,Abraham RS,et al.Serum reference intervals and diagnostic ranges for free kappa and free lambda immunoglobulin light chains:relative sensitivity for detection of monoclonal light chains[J].Clin Chem,2002,48(9):1437-1444.

[5]Campbell JP,Cobbold M,Wang Y,et al.Development of a highlysensitive multi-plex assay using monoclonal antibodies for the simultaneous measurement of kappa and lambda immunoglobulin free light chains in serum and urine[J].J Immunol Methods, 2013,391(1-2):1-13.

[6]te Velthuis H,Knop I,Stam P,et al.N Latex FLC-new monoclonal high-performance assays for the determination of free light chain kappa and lambda[J].Clin Chem Lab Med,2011,49(8):1323-1332.

[7]Lock RJ,Saleem R,Roberts EG,et al.A multicentre study comparing two methods for serum free light chain analysis[J].Ann Clin Biochem,2013,50(pt3):255-261.

[8]Vermeersch P,Van Hoovels L,Delforge M,et al.Diagnostic performance of serum free light chain measurement in patients suspected of a monoclonal B-cell disorder[J].Br J Haematol,2008,143(4): 496-502.

[9]Piehler AP,Gulbrandsen N,Kierulf P,et al Quantitation of serum free light chains in combination with protein electrophoresis and clinical information for diagnosing multiple myeloma in a general hospital population[J].Clin Chem,2008,54(11):1823-1830.

[10]Katzmann JA,Kyle RA,Benson J,et al.Screening panels for detection of monoclonal gammopathies[J].Clin Chem,2009,55(8): 1517-1522.

[11]Abraham RS,Clark RJ,Bryant CC,et al.Correlation of serum immunoglobulin free light chain quantification with urinary Bence Jones protein in light chain myeloma[J].Clin Chem,2002,48(4): 655-657.

[12]Middela S,Kanse P.Nonsecretory myeloma[J].Indian J Orthop 2009,43(4):408-411.

[13]Zamarin D,Giralt S,Landau H,et al.Patterns of relaps and progression in multiple myeloma patients after auto-SCT:implications for patients'monitoring after traasplantation[J].Bone Marrow Transplant,2013,48(3):419-424.

[14]Panadini G,Russo P,Bosoni T,et al.Identification of amyloidogenic light chains requires the combination of serum free light chain assay with immunofixation of serum and urine[J].Clin Chem,2009,55(3):499-504.

[15]Nasr SH,Valeri AM,Cornell LD,et al.Renal monoclonal immunoglobulin deposition disease:a report of 64 patients from single institution[J].Clin J Am Soc Nephrol,2012,7(2):213-239.

[16]Hutchison CA,Cockwell P,Stringer S,et al.Early reduction of serum free light chains associated with renal recovery in myeloma kidney[J].J Am Soc Nephrol,2011,22(6):1129-1136.

[17]Hutchison CA,Batuman V,Behrens J,et al.The pathogenesis and diagnosis of acute kidney injury in multiple myeloma[J].Nat Rev Nephrol,2011,8(1):43-51.

R446.62,R730.263,R446.11+2

A

1674-1129(2014)03-0233-04

10.3969/j.issn.1674-1129.2014.03.001

2014-02-25;

2014-03-20)

王继贵,男,1937年生,中南大学湘雅二医院检验科原主任,主任检验师,主要研究方向为临床生物化学.