NF-κB信号通路在宫颈癌中的研究进展

甘自立,朱瑞杰,朱会珍综述,林红审校

(1、东华理工大学校医院,江西南昌330006;2、南昌大学第一附属医院肿瘤科,江西南昌330006)

NF-κB信号通路在宫颈癌中的研究进展

甘自立1,朱瑞杰1,朱会珍1综述,林红2审校

(1、东华理工大学校医院,江西南昌330006;2、南昌大学第一附属医院肿瘤科,江西南昌330006)

宫颈癌是危害女性健康的第二大恶性肿瘤,化疗在宫颈癌治疗中占据重要位置,但是肿瘤耐药性和肿瘤负荷增加最终导致化疗效果不佳.研究发现,肿瘤放化疗中NF-κB活化可能是肿瘤有效治疗的障碍,以NF-κB为分子标靶探讨其活性调控对肿瘤增殖与凋亡及化疗敏感性的影响是近年研究热点.本文就其在宫颈癌中的研究进展作一综述.

宫颈癌;NF-κB;信号通路

1 NF-κB家族的组成和生物学特点

NF-κB信号传导通路的激活,主要有两条途径,分别是经典途径和非经典途径,主要涉及NF-κB抑制剂,IκB激酶,IκB和NF-κB家族成员[1]. NF-κB家族由p65,p50,p52,RelB,c-Rel五个成员构成,它们分别由RelA,NF-κB1,NF-κB2, RelB,c-Rel五个基因进行编码.根据结构、功能和合成方式的不同,Rel蛋白分为两组[2]:第一组包括NF-κB1(p50)和NF-κB2(p52),分别由其蛋白前体pl00和p105裂解而来,与本家族的其它成员结合成二聚体存留于胞浆,它们都包含有DNA结合区,但缺少转录活性区(TAD).第二组包括RelA, RelB,c-Rel,它们没有前体,除有RHD外,还有一个或多个转录活性区-TAD,对基因表达起正向调节作用.上述两组蛋白成员间可形成同源或异源二聚体[3].不同的Rel/NF-κB蛋白二聚体具有不同的结合序列(κB位点),因而具有各自的特性.绝大多数NF-κB蛋白(p50、p65、c-Rel、p52、c-Rel-p65)是转录激活的复合体,但p50同源二聚体和p52同源二聚体则是转录抑制的复合体.最常见的二聚体是p50-p65异源二聚体,也称NF-κB.

2 NF-κB的激活

NF-κB的激活机制是一个复杂的过程,尚未完全阐明.在大多数细胞中,Rel/NF-κB通过与抑制蛋白IκB直接结合形成无活性的三聚体存留于胞浆.NF-κB活化发生核易位时,首先需要抑制蛋白IκB的解离,胞外各种刺激的信号传递过程中,经过一系列酶激活,致使IκB降解,NF-κB二聚体发生核易位,从而调控相应基因的表达,这就是NF-κB的经典途径.静息状态下,NF-κB以非活性状态与IκBs结合存在于胞质中,不具备调节基因转录能力.当细胞受到刺激时,刺激物通过特定信号通路激活IKBs激酶(IKK)复合物,引起IκBα氨基末端的32和36位的丝氨酸残基磷酸化,使其泛素化并被蛋白酶体降解,释放的NF-κB可转移到核内,与NF-κB依赖基因结合,调节特定的基因表达.IκB磷酸化和降解是活化的关键步骤,其中Bcl-3不能使NF-κB产生胞质阻滞,而只是作为p50和p52同源二聚体转录协同者在核内正性调节基因表达.

3 NF-κB在宫颈癌发展中的作用

3.1 NF-κB在宫颈癌中的激活近年研究发现,在人乳腺癌[4]、膀胱癌[5]和胃癌[6]等多种肿瘤中有NF-κB持续活化的现象.已有研究表明宫颈癌中存在NF-κB的组成式激活.程大丽[7]等以125例不同组织学分级的人类宫颈癌组织标本为实验对象,应用免疫组织化学和免疫印迹方法检测NF-κB(p65)蛋白在不同组织学分级标本中的表达水平,结果显示在正常宫颈组织及轻度宫颈上皮内非典型增生组织中,RelA主要定位于胞浆,而在重度宫颈上皮内非典型增生及宫颈鳞状细胞癌中,RelA主要位于胞核中.免疫印记方法的结果与免疫组织化学的结果相同.Venkatraman[8]等在未处理的SiHa细胞检测到NF-κB活性的增加.Prusty[9]等研究结果显示,宫颈鳞癌中存在NF-κB组成性激活,并以p50/p50同源二聚体为主.在宫颈癌中NF-κB组成性激活的存在说明NF-κB有可能在宫颈癌发生发展中起作用.

3.2 NF-κB与HPV HPV感染是宫颈癌及癌前病变的主要原因之一.已有研究显示,在HPV长控制区存在功能性的NF-κB位点,NF-κB与之结合后发挥抑制长控制区的抑制HPV转录的功能.其中, HPVE6、E7蛋白是HPV的两个主要癌蛋白,它们通过操控宿主重要调节蛋白的功能来促进增殖. Dimitry[3]的研究表明,E7蛋白片段与IκB激酶复合物相结合并减弱IKKα,IKKβ的激酶诱导活性,因此导致IκBα的磷酸化和降解.间接免疫荧光法提示E7蛋白影响TNF-α诱导的NF-κB核转位,从而使得NF-κB不与它的同源DNA结合.HPV癌基因介导的NF-κB活性的抑制,使得HPV逃离了免疫系统的监视,促进了宫颈癌的发生发展.

Nees[10]等体外培养感染逆转录病毒(HPVE6和E7)的宫颈角质化细胞,RT-PCR方法显示宫颈角质化细胞受TNF刺激后,E6和E7蛋白可以刺激多种与NF-κB激活相关的基因表达.免疫印迹方法显示,RelA蛋白表达增加;EMSA方法显示,E6蛋白明显增加NF-κB DNA结合活性;cDNA微点阵方法的数据显示,E6表达诱导NF-κB反应性基因的表达.结果表明,HPV E6和E7蛋白在人宫颈角质化细胞可增加NF-κB活性进而上调一些NF-κB反应性基因.

James[11]等人的研究指出HPV E6蛋白以依赖PDZ结构域的方式诱导含有p52的NF-κB二聚体与NF-κB结合位点结合,促进NF-κB效应启动子的活性,上调NF-κB效应基因cIAP2(抑制凋亡基因)的表达.不仅如此,E6通过诱导TNF以及PDZ结构域的存在来引起凋亡耐受.研究NF-κB和HPV的关系,对探讨该病毒在肿瘤中的发病机制和疾病的预防治疗有很大意义.但是目前HPV癌蛋白激活的是NF-κB具体哪个部分、E6和E7哪个更重要、NF-κB激活和E6已知功能间的关联以及如何调整NF-κB依赖基因方面尚待进一步研究.

3.3 NF-κB与凋亡大量研究表明,活化的NF-κB在细胞凋亡中具有抗凋亡和促凋亡的双重作用. Chen[12]等研究发现,NF-κB亚单位的种类及数量在细胞凋亡中起着决定性的作用,当RelA(p65)过表达时发生凋亡抑制;当c-Rel表达增加时,则促进凋亡的发生.这些研究结果表明,NF-κB在细胞凋亡中是起抑制凋亡还是促进凋亡作用取决于不同的刺激因素及细胞类型,并与激活的NF-κB亚单位的种类及数量有关,其具体机制有待进一步的研究.与宫颈癌有关研究指出:NF-κB的作用主要是抗细胞凋亡和保护细胞,NF-κB的抗凋亡作用主要是通过调节靶基因的转录实现的.NF-κB活化能上调凋亡蛋白抑制剂(IAPs)[13]和抗凋亡Bcl-2 家族成员的表达[14],从而抑制细胞凋亡.

肿瘤抑制因子p53通过促进细胞周期阻滞及细胞凋亡来抑制细胞生长,大部分肿瘤中存在p53的突变及缺失.Kevin[15]等人的研究指出NF-κB信号通路与p53诱导的细胞凋亡相关.他们通过构建p53诱导型Saos-2细胞(不表达内源性p53的肿瘤细胞株),这些细胞中发生了广泛的细胞程序性死亡,同时利用EMSA的方法检测出NF-κB DNA结合活性也明显升高,说明NF-κB参与了p53诱导的凋亡.在宫颈癌Hela细胞中,经低剂量γ射线照射后,NF-κB活化引起细胞中SOD表达改变能抵抗由顺铂诱导的细胞凋亡.因此近年来,作为肿瘤新的治疗靶点,NF-κB已成为新的研究热点,其具体机制尚在探讨中.

4 NF-κB在宫颈癌治疗中的作用

4.1 NF-κB对放化疗的影响NF-κB不仅在宫颈癌的发生发展中起到分子开关作用,同时也能影响宫颈癌细胞的迁移和侵袭,从而影响宫颈癌治疗的有效性.肿瘤细胞的迁移是引起治疗失败的主要原因,而NF-κB信号通路在其中起到关键作用.在郭菲[16]等人的研究中,利用氯化镧(一种稀土化合物)处理的人宫颈癌细胞,进行免疫蛋白印记和NF-κB-DNA结合活性试验分析NF-κB活性的表达,结果发现NF-κB(p65)蛋白的表达显著降低,受其调控的MMP-1和MMP-9(基质金属蛋白酶)表达也明显下调,说明了氯化镧通过抑制NF-κB信号通路明显抑制了人宫颈癌Hela细胞的迁移和侵袭,从而提高了治疗的成功率.

染料木黄酮作为一种酪氨酸蛋白酶抑制剂,与化疗联用可以增加宫颈癌对顺铂的敏感性, Sahin[17]等人的研究发现25μmol的染料木黄酮联合250nM的顺铂可以明显的抑制细胞生长,利用免疫印迹实验分别检测NF-κB(p65)蛋白在顺铂组、染料木黄酮组、两药联合组的Hela细胞中的表达水平.结果显示,与对照组相比,顺铂组处理后的Hela细胞NF-κB(p65)蛋白的表达水平上调了1.5倍,染料木黄酮组的Hela细胞NF-κB(p65)蛋白的表达水平下降了75%,两药联合组NF-κB(p65)蛋白的表达水平下降了80%,说明抑制NF-κB(p65)蛋白的表达可以明显改善因顺铂引起的化疗耐受.

国内邢丽娜[18]等人的研究发现在宫颈癌HeLa细胞中,NF-κB抑制剂(PDTC及PS-341)均可抑制NF-κB的表达从而增加了由射线介导的细胞凋亡,提高HeLa细胞对放疗的敏感性.同时,在前列腺癌中,也发现抑制NF-κB的活性能增加放疗敏感性.Kozakai[19]等人将新型的NF-κB抑制剂, DHMEQ应用于经放射线处理后的前列腺癌细胞,细胞周期分析显示,细胞停滞于G2/M期,放疗诱导的NF-κB受到了DHMEQ的抑制.体外研究结果显示,在接受治疗的64d后,肿瘤缩小程度与对照组相比,放疗组是64.7%,DHMEQ组是77.1%,两者联合组是85.1%.说明DHMEQ能抑制放疗诱导的NF-κB活性,同时减轻放疗耐受反应.

放化疗会引起DNA片段的损伤并通过激活IKK来增加NF-κB DNA结合活性,核蛋白ATM的DNA片段损伤后,通过NF-κB经典途径激活IKK使其与NF-κB分离,从而转位至胞核.Barre[20]的研究认为DNA损伤以经典/非经典途径来诱导NF-κB(p52)的产生.Bednarski[21]等人利用基因敲除和基因沉默的肿瘤模型证明IKK活性与NF-κB诱导的化疗耐受密切相关.在化疗耐药癌细胞株中发现NF-κB蛋白的高表达[22],对放疗耐受的早期喉癌病人样本也同样发现NF-κB的高表达[23],因此,NF-κB抑制剂也许是放化疗耐受病人的新曙光.

4.2 NF-κB抑制剂在宫颈癌的治疗通过动物模型和人类疾病的大量研究,发现NF-κB在许多疾病发病机制中扮演关键角色,因而针对NF-κB的靶向治疗可能对许多相关疾病奏效,并已得到证实.在宫颈癌治疗方面,NF-κB抑制剂的应用还需进行临床实验.最近,Wang[24]的研究发现Morusin (桑辛素)作为肿瘤抑制剂,其通过NF-κB信号通路发挥抗肿瘤作用.经桑辛素处理的人宫颈癌细胞,其增殖、转移及肿瘤形成速度明显减弱,DAPI染色的凋亡细胞增多,凋亡性DNA片段形成;免疫印迹的结果显示NF-κB(p65)的表达以剂量依赖性方式下调.证实了Morusin(桑辛素)能靶向人宫颈癌细胞,通过NF-κB信号通路抑制其生长和迁移.

孙建国[25]等人从蘑菇中提取到一种天然药物成分Clitocine(克力托辛),并发现该化合物能有效抑制多种肿瘤细胞的增殖,其分子机理就是抑制了NF-κB信号通路.MTT法结果显示该化合物对宫颈癌细胞HeLa、肝癌细胞HepG2、胃癌细胞SGC-7901等多种癌细胞都表现出较高的活性抑制.将Clitocine与阿霉素(Doxorubicin)联合使用可有效增强化疗耐药细胞对阿霉素的敏感性,流式细胞术的数据显示,Clitocine能够增加阿霉素在细胞内的积累,明显提高低浓度下阿霉素对耐药性肿瘤细胞的杀伤作用.电泳迁移率实验(EMSA)发现Clitocine能够有效抑制NF-κB的激活,并阻止活化的NF-κB向细胞核内的转运.他们将耐药性肿瘤细胞R-HepG2接种到裸鼠皮下,将剥离的肿瘤组织行免疫组织化学实验,结果表明Clitocine能够抑制体内NF-κB的表达.同时,荧光定量PCR数据显示Clitocine通过下调NF-κB来抑制P-糖蛋白的表达,继而逆转肿瘤细胞的耐药性.

综上所述,NF-κB异常活化后通过不同的作用机制调控其下游基因,促进宫颈癌的发生发展.因此,抑制NF-κB的活性成为宫颈癌治疗的分子基础,也为攻克宫颈癌放化疗耐受提供了新的手段.然而,进一步将其应用于临床的治疗,还需深入探讨NF-κB作用于宫颈癌的准确时间点及部位,NF-κB抑制剂在治疗的同时可能发生的毒副反应,患者对其的耐受力等问题.总之,我们推测NF-κB抑制剂的应用将对肿瘤的扩散转移提供新的预防治疗手段,抑制NF-κB活性的治疗也许能增加肿瘤对放化疗的敏感性,也可作为当前治疗的辅助手段.

[1]Gilmore TD.Introduction to NF-κB:players,pathways,perspectives[J].Oncogene,2006,25(51):6680-6684.

[2]Karin M,Ben-Neriah Y.Phosphorylation meets ubiquitination:the Control of NF-κB activity[J].Annu Rev Immunol,2000,18:621-663.

[3]Spitkovsky D,Hehner SP,Hofmann TG,et al.The Human Papillomavirus oncoprotein E7 attenuates NF-κB activation by targeting the IkB kinase complex[J].Biol Chem,2002,277(28):25576-25582.

[4]邓元,张学斌,王鸿雁,等.乳腺癌组织中核转录因子NF-kB和抑癌基因p53的表达及其意义[J].肿瘤防治研究,2007,34(5):342-346.

[5]谢东华,唐孝达,夏术阶,等.核转录因子kB在膀胱癌的表达及临床意义[J].癌症,2002,21(6):663-667.

[6]Li Q,Yu YY,Zhu ZG,et al.Effect of NF-kappaB constitutive activation on proliferation and apoptosis of gastric cancer cell lines[J]. Eur Surg Res,2005,37(2):105-110.

[7]程大丽,张淑兰,郭欣宇.NF-kB激活在宫颈重度非典型增生及鳞癌中的作用[J].中国病理生理杂志,2006,22(4):39-42.

[8]Venkatraman M,Anto RJ,Nair A,et al.Biological and chemical inhibitors of NF-kappaB sensitize SiHa cells to cisplatin-induced apoptosis[J].Mol Carcinog,2005,44(1):51-59.

[9]Prusty BK,Husain SA,Das BC,et al.Constitutive activation of nuclear factor-κB:profemtial homodimerization of p50 subunits in cervical carcinoma[J].Front Biosci,2005,10(3):1510-1519.

[10]Nees M,Geoqheqan JM,Hyman T,et al.Papillomavirus type 16 oncogenes downregulate expression of interferon-responsive genes and upregulate proliferation-associated and NF-κB-responsive genes in cervical keratinocytes[J].J Virol,2001,75(9):4283-4296.

[11]James MA,Lee JH,Klingelhutz AJ.Human papillomavirus type 16 E6 activates NF-κB,induces cIAP-2 expression,and protects against apoptosis in a PDZ binding motif-dependent manner[J].J Virol,2006,80(11):5301-5307.

[12]Chen X,Kandasamy K,Srivastava RK.Differential roles of Re-lA (p65)and c-Rel subunits of nuclear factor kappa B in tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand signaling[J].Cancer Res,2003,63(5):1059-1066.

[13]Deveraux QL,Roy N,Stennicke HR,et al.IAPs block apoptotic events induced by caspase-8 and cytochrome c by direct inhibition of distinct caspases[J].EMBO,1998,17(8):2215-2223.

[14]Chen QM,Tu VC.Apoptosis and heart failure:mechanisms and therapeutic implications[J].Am J Cardiovasc Drugs,2002,2(1):43-57.

[15]Merda K,Ryan MK,Rice NR.Role of NF-κB in p53-mediated programmed cell death[J].Nature,2002,404(3):441-455.

[16]Chen HW,Liu SS,Miao LF,et al.Inhibitory effects of lanthanum chloride on migration and invasion of cervical cancer cells[J].J Rare Earths,2013,31(1):94-100.

[17]Sahin K,Tuzcu M,Basak N.Sensitization of cervical cancer cells to cisplatin by genistein:the role of NF-κB and Akt/mTOR signaling pathways[J].J Oncol,2012,2012(1):665-671.

[18]邢丽娜,刘晓.NF-κB抑制对宫颈癌HeLa细胞放疗敏感性影响的观察[J].中华肿瘤防治杂志,2008,15(21):368-371.

[19]Kozakai N,Kikuchi E,Hasegawa M.Enhancement of radiosensitivity by a unique novel NF-κB inhibitor,DHMEQ,in prostate cancer[J].Br J Cancer,2012,107(4):652-657.

[20]Barre B,Coqueret O,Perkins ND.Regulation of activity and function of the p52 NF-κB subunit following DNA damage[J].Cell Cycle,2010,9(24):4795-4804.

[21]Bednarski BK,Ding X,Coombe K,et al.Active roles for inhibitory κB kinases α and β in nuclear factor-κB mediated chemoresistance to doxorubicin[J].Mol Cancer Ther,2008,7(7):1827-1835.

[22]Wang W,Cassidy J.Constitutive nuclear factor-κB mRNA,proteinoverexpressionandenhancedDNA-bindingactivityin thymidylate synthase inhibitor-resistant tumour cells[J].Cancer, 2003,88(4):624-629.

[23]Yoshida K,Sasaki R,Nishimura H,et al.Nuclear factor-kB expression as a novel marker of radioresistance in early-stage laryngeal cancer[J].Head Neck,2010,32(5):646-655.

[24]Wang L,Guo HJ,Yang LQ,et al.Morusin inhibits human cervical cancer stem cell growth and migration through attenuation of NF-κB activity and apoptosis induction[J].Mol Cell Biochem, 2013,379(1-2):7-18.

[25]孙建国.新型NF-κB抑制剂Clitocine抑制耐药性肿瘤细胞的分子机制研究[D].浙江大学硕士学位论文,2012.

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实验与检验医学计量使用与统计学要求

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甘自立:女,生于1987年10月,南昌大学硕士研究生,研究方向:肿瘤免疫学,e-mail:295733625@qq.com.cn.

林红:女,生于1961年10月,教授,主任医师,研究方向:肿瘤免疫学.