重组海参溶菌酶的表达及其性质

卢 冬， 丛丽娜， 姜启晨， 谭广毅

（大连工业大学 生物工程学院，辽宁 大连 116034）

0 引 言

溶菌酶（Lysozyme，EC 3.2.1.17）全称为1，4－β－N－溶菌酶，又称胞壁质酶。它的作用机理是作用于细菌细胞壁肽聚糖中的糖苷键，使肽聚糖的骨架遭到破坏，致使细菌因细胞壁裂解而死亡［1］。溶菌酶普遍存在微生物、植物和动物的组织或体液中，是生物体内重要的免疫因子［2］。在大部分水生类动物中，引起危害较严重的病原菌是以副溶血性弧菌为主的革兰阴性菌［3］，因此利用重组水产动物溶菌酶可防治水生动物的病害。Sim等［4］研究发现，外源蛋白在大肠杆菌表达系统中低温诱导可以提高可溶性蛋白的表达量，同时降低蛋白质合成速率，改变多肽折叠动力学，增加蛋白质的正确折叠率。

本试验室已经筛选出一株遗传性能稳定的重组海参溶菌酶基因工程菌，即E.coli Rosetta（DE3）pLysS／pET－32a（＋）－SjLys［5］。在此基础上，本试验在摇瓶水平上对影响该基因工程菌表达重组海参溶菌酶的主要培养条件进行了考察，利用正交试验分析［6］，获得该基因工程菌适宜的培养基诱导表达条件。研究结果对利用基因工程菌后续扩大发酵生产重组海参溶菌酶具有一定的参考价值。

1 材料与方法

1.1 菌 种

重组海参溶菌酶基因工程菌E.coli Rosetta（DE3）pLysS／pET－32a（＋）－SjLys，由本研究室构建。

1.2 试 剂

蛋白质分子质量Marker，宝生物工程（大连）有限公司；异丙基硫代β－D－半乳糖苷（IPTG），Invitrogen公司；HisTrap HP，GE Healthcare公司；Acrylamide、Triton X－100、Chloramphenicol和Ampicillin Sodium，Amresco（美国）公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.3 方 法

1.3.1 重组蛋白SjLys的诱导表达及纯化

重组 质 粒 pET32a（＋）－SjLys 在 E.coli Rosetta（DE3）pLysS中的诱导、表达及纯化过程，参见参考文献［5］。

1.3.2 培养基成分对目的蛋白表达量的影响

工程菌培养基的基本成分为酵母浸粉5g／L、蛋白胨10g／L、氯化钠10g／L，在此基础上选择影响目的蛋白表达量的不同金属离子，即ZnSO4、FeSO4、MgSO4、KH2PO4。对4个影响因素分别取3个不同浓度的数据，按照L9（34）正交表进行试验，确定最佳培养基离子成分的条件。

以培养基离子组分最佳条件为基础，选取4个因素即蛋白胨、氯化钠、酵母浸粉、葡萄糖。对这4个因素分别取3个不同浓度的数据，按照L9（34）正交表进行试验，以确定最佳培养基组分。

1.3.3 诱导表达条件的优化

1.3.3.1 温度对目的蛋白表达量的影响

将重组海参溶菌酶工程菌接种至优选后培养基中（含100μg／mL Amp），37 ℃、160r／min培养至OD600达0.6～0.7后开始诱导，加入终浓度0.3mmol／L的IPTG 后，分别在22、24、26、28、30、32、34和36℃下诱导表达14h。

1.3.3.2 诱导时间对目的蛋白表达量的影响

将该工程菌种接种至优选后的培养基中（含100μg／mL Amp），37 ℃、160r／min 培 养 至OD600达0.6～0.7后开始诱导，加入终浓度0.3mmol／L IPTG，在30℃下分别诱导表达2、4、6、8、10、12、14、16和18h。

1.3.3.3 转速对目的蛋白表达量的影响

将该工程菌种接种至优选后培养基中（含100μg／mL Amp），37℃、160r／min培养至 OD600达0.6～0.7后开始诱导，加入终浓度0.3mmol／L IPTG，分别在40、60、80、100、120、140、160、180和200r／min条件下30℃诱导表达14h。

1.3.3.4 诱导剂浓度对目的蛋白表达量的影响

将该工程菌种接种至优选后培养基中（含100μg／mL Amp），37 ℃、160r／min 培 养 至OD600达0.6～0.7后开始诱导，在30 ℃、14h、140r／min条件下，分别加入IPTG至终浓度0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6和0.7mmol／L。

1.4 目的蛋白的定量分析

用SDS－PAGE和Bandscan图像分析软件［7］对工程菌表达的目的蛋白进行定量分析。

1.5 抑菌活性的检测

将重组蛋白SjLys溶于缓冲液PBS（pH 7.4）中。以金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、溶壁微球菌（Micrococcus lysodeikticus）和副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）作为抑菌试验的指示菌株，采用管碟法测定重组蛋白SjLys的抑菌圈直径。取200μL的上述菌株的稀释菌液均匀涂布在固体平皿培养基上，放入2个灭过菌的牛津杯，称取适量重组蛋白SjLys冻干粉溶于PBS中并分成2份，取1份进行100℃、10min加热处理，分别向2个牛津杯中加入未经热处理和经热处理后的重组蛋白SjLys溶液各200μL，30℃过夜培养16h，测量抑菌圈大小。试验重复3次，结果取平均值。

图1 不同金属离子组分培养基的SjLys蛋白电泳Fig.1 SDS－PAGE analysis of the recombinant SjLys expression with different metal ions in fermentation media

2 结果与分析

2.1 培养基组分对重组蛋白SjLys表达量的影响

2.1.1 不同金属离子对蛋白表达量的影响

由图1可知，诱导后的样品在标准蛋白Marker 29ku处有明显条带，表明该重组蛋白SjLys表达成功。由表1可知，3号目的蛋白表达量最大（13.4mg／L），说明金属离子对海参溶菌酶蛋白表达量有一定影响。因此，选择3号培养基。

表1 培养基金属离子组分对蛋白表达量影响的正交试验结果Tab.1 Effect of metal ion composition in medium on protein expression through orthogonal test

表2 培养基组分对蛋白表达量影响的正交试验结果Tab.2 Effect of medium components on protein expression through orthogonal test

2.1.2 培养基组分对蛋白表达量的影响

以培养基离子组分最佳条件为基础，确定培养基组分最佳条件。试验结果如图2和表2所示。其中8号目的蛋白表达量最大（26.2mg／L），其培养基成分为蛋白胨10g／L，氯化钠7.5g／L，酵母浸粉2.5g／L和葡萄糖10g／L。重复试验结果稳定。

图2 不同培养基组分培养基的SjLys蛋白电泳Fig.2 SDS－PAGE analysis of the the recombinant SjLys expression with different medium components in fermentation media

图3 重组SjLys诱导表达条件的优化Fig.3 The optimal expression conditions of the recombinant SjLys

2.2 诱导表达条件的优化

在确定最佳培养基成分和培养基金属离子成分的条件后，分别研究诱导温度、时间、转速和诱导剂浓度对重组蛋白SjLys表达量的影响，结果如图3所示，确定最佳诱导条件为30℃、140r／min、IPTG浓度0.3mmol／L，诱导后继续培养14h，目的蛋白分泌表达量可达到30～40mg／L。

2.3 重组蛋白SjLys的抑菌活性

采用管碟法测定重组蛋白SjLys对金黄色葡萄球菌、溶壁微球菌和副溶血弧菌的抑菌活性，结果如表3和图4所示。结果表明，重组蛋白Sjlys对这3种菌均有明显的抑制作用，尤其加热蛋白失活后，其抑菌活性增加。

表3 重组SjLys的抑菌活性Tab.3 Antimicrobial activities of the recombinant SjLys

图4 重组SjLys热处理前后的对照抑菌特性Fig.4 The antimicrobial activities of recombinant SjLys with no heating（left）and heating treatment（right）

3 结 论

通过对重组海参溶菌酶基因工程菌发酵条件等方面的研究，确定了可溶性蛋白高效表达的诱导条件：最佳诱导条件为30℃、140r／min、IPTG浓度0.3mmol／L，诱导后继续培养14h，目的蛋白分泌表达量可达到30～40mg／L。当诱导温度为30℃时，可溶性目的蛋白高效表达，并达到最大值。结果表明，重组SjLys对革兰氏阴性致病菌副溶血弧菌和溶壁微球菌，革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌有明显的抑制作用，尤其是经热处理后，该重组蛋白的抑菌活性增强，这与海参溶菌酶的基因结构有关［8］，此特性对海参溶菌酶作为水产动物饲料添加剂的应用非常有利。

［1］李鹤，马力，王维香.溶菌酶的研究现状［J］.食品研究与开发，2008，29（1）：182－185.

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［3］HIKIMA S， HIKIMA J，ROJTINNAKORN J，et al.Characterization and function of kuruma shrimp lysozyme possessing lytic activity against Vibrio species［J］.Gene，2003，316（16）：187－195.

［4］SIM B J，TAN D S H，LIU Xianan，et al.Production of high levels of soluble recombinant Strep to mycesclavuligerusiso penicillin N synthase in Escherichia coli［J］.Journal of Molecular Catalysis B：Enzymatic，1996，2（2／3）：71－83.

［5］常艺海，丛丽娜，卢冬，等.重组海参溶菌酶基因工程菌的构建及原核表达［J］.大连工业大学学报，2012，31（6）：392－394.（CHANG Yi－hai，CONG Li－na，LU Dong.Construction of recombinant bacteria for sea cucumber lysozyme and its prokaryotie expression［J］.Journal of Dalian Polytechnic University，2012，31（6）：392－394.）

［6］张毅，屈贤铭，杨成利.融合蛋白基因工程应用及研究［J］.生物工程进展，2002，20（3）：13－17.

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［8］CONG Li－na，YANG Xi－jian，WANG Xiu－xia，et al.Characterization of an i－type lysozyme gene from the sea cucumber Stichopus japonicus，and enzymatic and nonenzymatic antimicrobial activities of its recombinant protein［J］.Journal of Bioscience and Bioengineering，2009，107（6）：583－588.