艾叶挥发油提取工艺的优化

赵志鸿 耿 楠 黄勇勇 吴 芳 李锦玉 王桂芳 张壮丽 张小俊

1.郑州大学医药科学研究院，河南郑州 450052；2.河南省肝病药理重点实验室，河南郑州 450052；3.郑州大学药学院，河南郑州 450001；4.郑州大学临床医学系，河南郑州 450001

艾叶为菊科多年生草本植物艾（Artemisia argyi Lévl.et Vant.）的干燥叶，全国各地区均产，资源丰富。 现代研究显示，其主要含有挥发油、甾萜类、黄酮类、香豆素类、多糖及一些小分子成分等[1-3]，其中挥发油、黄酮类为主要有效成分[4-6]。艾叶是我国历史悠久且临床常用的中药材[7]，有温经止血、散寒止痛、降湿杀虫等[8]功效，现代实验表明其具有增强免疫抗感染、平喘镇咳、护肝利胆、止血与抗凝血及抗自由基等作用[9-11]，挥发油是艾叶的主要药效成分群之一，提取方法和工艺是挥发油质量和药理活性的保证，对于艾叶资源的开发利用也具有重要意义。本课题组前期研究发现艾叶挥发油具有抗乙肝病毒作用，并对其化学成分进行了分析[12]，为将其研制成抗乙肝病毒新药，研究挥发油的提取工艺。水蒸气蒸馏法适合工业生产推广，环保、经济。 本文以正交试验法[13-14]对艾叶挥发油水蒸气蒸馏法提取工艺进行优化， 可提高挥发油的收率和质量，降低成本，具有良好的应用前景。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药材

艾叶产地河南省驻马店，由河南省中医学院药学院生药学科董诚明教授鉴定为菊科植物艾（Artemisia argyi Lévl.et Vant.）的干燥叶。使用时粉碎使通过二号至三号筛，混合均匀。

1.1.2 仪器及试剂

挥发油提取器 （相对密度小于1 型）；KDM-4 型电子可调自动恒温仪（山东菏泽市仪器制刷厂制造）；电子天平AR1530（梅特勒-托利多仪器上海有限公司制造）；蒸馏水（自制）。

1.2 方法

1.2.1 艾叶挥发油的提取方法

参照《中国药典》2010 年版一部附录ⅩD 挥发油测定法（甲法）[15]。 取粉碎的艾叶约100.00 g，精密称定，加蒸馏水适量，浸泡，加热提取，收集挥发油，计算挥发油得率，密封，冷藏保存。艾叶挥发油得率计算公式：挥发油得率（%）＝A/B×100%。

1.2.2 单因素试验

分别考察料液比、浸泡时间和提取时间对艾叶挥发油得率的影响。

1.2.2.1 料液比的影响 取粉碎的艾叶约100 g， 精密称定，加蒸馏水，料液比（W/V）分别为：1∶8、1∶10、1∶12、1∶14、1∶16，浸泡2 h，提取3 h，各条件分别平行3次，考察不同的料液比下艾叶挥发油的得率。

1.2.2.2 浸泡时间的影响 取粉碎的艾叶约100 g，精密称定，加蒸馏水，料液比（W/V）1∶12，浸泡时间分别取：0、1、2、4、6 h，提取3 h，各条件分别平行3 次，考察不同的浸泡时间下艾叶挥发油的得率。

1.2.2.3 提取时间的影响 取粉碎的艾叶约100 g，精密称定，加蒸馏水，料液比（W/V）1∶12，浸泡2 h，提取时间分别为：1、2、3、4、5 h， 各条件分别平行3 次，考察不同的提取时间时下叶挥发油的得率。

1.2.3 正交试验及最优提取条件的验证

1.2.3.1 因素水平设计 由单因素试验结果选择考察因素为提取时间（A）、料液比（B）和浸泡时间（C），各因素分别设3 个水平，考察指标为挥发油得率，设计三因素三水平的正交试验。 见表1。

表1 正交试验因素水平表

1.2.3.2 正交试验设计 取粉碎的艾叶约100 g， 精密称定，按表2 设计的L9（34）正交表进行试验。

1.2.3.3 最优工艺条件验证试验 以优选出的提取条件进行试验，重复3 次，以RSD 值小于5%为必要条件，确定优化条件下艾叶挥发油的得率。

1.2.4 统计学方法

采用统计软件SPSS 15.0 对实验数据进行分析[16-17]，计量资料数据以均数±标准差（）表示，采用单因素方差分析进行数据比较，采用t 检验。 以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

表2 L9（34）正交试验表

2 结果

2.1 单因素试验结果与分析

2.1.1 料液比的影响

料液比（W/V）分别为：1∶8、1∶10、1∶12、1∶14、1∶16时，对应的挥发油得率依次为：（0.350±0.017）%、（0.424±0.013）%、（0.421±0.016）%、（0.414±0.021）%、（0.408±0.014）%，二者关系见图1。

图1 料液比与挥发油得率的关系

由图1 试验结果看出：在浸泡2 h、提取时间为3 h 的提取条件下， 料液比各水平间的挥发油得率由高到低依次为：1∶10＞1∶12＞1∶14＞1∶16＞1∶8。料液比为1∶10 时得率最高，为（0.424±0.013）%，与料液比1∶8 比较，差异有统计学意义（P ＜0.05），而与1∶12、1∶14、1∶16 之间比较，差异无统计学意义（P ＞0.05），即料液比为1∶10、1∶12、1∶14、1∶16 对挥发油的得率并无太大影响，但由于料液比在1∶10、1∶12 时挥发油得率较高，且综合考虑工业生产成本，选择正交试验中料液比的各水平为1∶10、1∶12、1∶14。

2.1.2 浸泡时间的影响

浸泡时间分别为：0、1、2、4、6 h，对应的挥发油得率依次为：（0.343±0.021）%、（0.378±0.014）%、（0.425±0.013）%、（0.417±0.012）%、（0.365±0.022）%， 二者关系见图2。

图2 浸泡时间与挥发油得率的关系

由图2 试验结果看出：料液比1∶12、提取时间为3 h 的提取条件下， 依艾叶挥发油得率高至低顺序的浸泡时间为：2 h＞4 h＞1 h＞6 h＞0 h。 艾叶经浸泡后提取较不浸泡挥发油得率提高。 其中浸泡2 h 的得率最高，为（0.425±0.013）%，约高于不浸泡时得率的23.91%，与浸泡4 h 比较，差异无统计学意义（P ＞0.05），浸泡时间超过4 h 后，挥发油得率显著降低，差异有统计学意义（P ＜0.05），浸泡1、2、4 h 挥发油得率较高。 因此，在正交试验中浸泡时间水平选择为1、2、4 h。

2.1.3 提取时间的影响

提取时间分别为1、2、3、4、5 h， 对应的挥发油得率依次为：（0.312±0.012）%、（0.365±0.019）%、（0.412±0.014）%、（0.418±0.014）%、（0.420±0.016）%， 二者关系见图3。

图3 提取时间与挥发油得率的关系

由图3 试验结果看出：在料液比1∶12、浸泡时间为2 h 的条件下，提取时间各水平间的挥发油得率由高到低依次为：5 h＞4 h＞3 h＞2 h＞1 h。 挥发油得率随着提取时间的增加而增加， 提取时间由1 h 增至3 h时，得率由（0.312±0.012）%增至（0.412±0.014）%，增加约32.05%，且3、4、5 h 得率显著增加，与2 h 比较，差异均有统计学意义（均P ＜0.05）。 3 h 后得率间的增加差异无统计学意义（P ＞0.05），5 h 比3 h 仅增加约1.94%，综合考虑成本，正交试验中提取时间选择1、2、3 h 三个水平。

2.2 正交试验结果与分析

2.2.1 正交试验

正交试验结果见表3， 利用正交试验软件对表3中的数据进行方差分析，结果见表4。

表3 L9（3）4 正交试验结果与分析

表4 方差分析表

由表3 得知，RA＝0.096、RB＝0.007、RC＝0.021 各因素主次顺序为A＞C＞B，即直观分析：A 是最重要因素，对结果影响最大，其次是C，B 是最次要因素。 方差分析结果表明： 对艾叶挥发油得率的影响，A 差异有统计学意义（P ＜0.05），B 和C 差异无统计学意义（P ＞0.05）。 两者结果一致，提取时间是艾叶挥发油得率的主要影响因素。

根据挥发油提取条件的优选原则， 由表3 可知：kA3＞kA2＞kA1，kB1＞kB3＞kB2，kC3＞kC2＞kC1确定艾叶挥发油的最优提取工艺为A3B1C3，即料液比选择1∶10，浸泡4 h，提取3 h。

2.2.2 验证试验

由表5 结果显示，在优选的提取条件下，艾叶挥发油平均得率为0.416%，RSD=2.64%（n=3）， 实验重复性好，结果可靠。

表5 最优提取工艺（A3B1C3）下的验证试验

3 讨论

通过单因素试验考察并选择正交试验各因素水平，用正交试验对艾叶挥发油水蒸气蒸馏法提取工艺进行了优选， 对优选出的最佳工艺条件进行了验证，证明重复性好，方法可行，结果可靠。

挥发油常见的提取方法有水蒸气蒸馏法、 微波法、溶剂回流法、超临界流体萃取法等，其中水蒸气蒸馏法是分析植物中挥发性成分的传统提取技术，操作简便、效率较高，适合工业生产推广，环保、经济[18-19]。

以水蒸气蒸馏法提取艾叶挥发油时，挥发油由水介质慢慢浸出，随水蒸气蒸出，因此应适当选择艾叶与水的比例。水量少时，水散作用进行不彻底，艾叶不能被充分浸泡，蒸气量生成的就少，得油率将受到影响，试验中当料液比为1∶8 时，上述原因使得挥发油得率不高；料液比为1∶10、1∶12、1∶14、1∶16 时，挥发油得率较高，分析原因可能是水量增大，水与挥发油两者的接触界面浓度差增大，更利于挥发油的扩散和溶解，从而使传质速率得到提高；若加水量过多，会增加耗能，从而使工业生产成本增加，因此试验中料液比的水平为1∶10、1∶12、1∶14。

艾叶挥发油得率随提取时间的增加而增加，3 h前挥发油得率增加明显，3 h 后得率增加缓慢，与艾叶挥发油不断蒸出后含量的减少有关。

艾叶是我国传统中药，挥发油是其诸多药理活性的主要有效成分群，艾叶挥发油质量的稳定是其药理活性的保证，因此其提取工艺的研究具有应用价值[20-21]，尤其水蒸气蒸馏法提取，环保、经济，适合推广。

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