17-AAG 对人肝癌HepG2 细胞株增殖和凋亡作用的影响

陈美霓 郭 巍 赵菊梅 魏晓丽 王爱红 庞秋霞

1.延安大学医学院实验中心，陕西延安 716000；2.延安大学医学院附属医院泌尿外科，陕西延安 716000

原发性肝细胞癌是全球第5 位常见恶性肿瘤，其 病死率占恶性肿瘤病死率的第3 位。 据2008 年的报道，中国肝癌5 年患病数为29.6 万例，约占全球肝癌5 年患病数的48.3%。 在未来10 年肝癌的发病数和病死数均将呈现上升趋势。 采用手术切除等治愈方法仅适合10%～20%的肝癌患者，在5 年内复发率仍超过70%[1]。 所以寻找以肿瘤细胞特性为作用靶点的分子靶向治疗有着特别重要的意义。 HSP90 抑制剂17-丙烯胺基-17-去甲氧格尔德霉素（17-AAG）对多种肿瘤细胞有抑制增殖、诱导凋亡的作用，但目前尚未见17-AAG 对肝癌细胞生长及凋亡影响的报道，本文探讨17-AAG 对HepG2 细胞增殖、生长周期、诱导凋亡及对重组人血管内皮生长因子相关蛋白（VEGF-C）的表达进行初步探讨，为17-AAG 治疗肝癌的应用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

人肝癌细胞株HepG2 由延安大学医学院实验中心提供。 RPMI-1640 培养基（赛默飞世尔公司），17-AAG、四甲基偶氮唑蓝（MTT）及碘化丙啶（PI）（美国Sigma 公司）AnnexinV FITC 细胞凋亡检测试剂盒（美国BD pharmingen 公司），RNase A 酶（德国Merck 公司），胎牛血清（美国Hyclone 公司），兔抗人VEGF-C蛋白、兔二抗及DAB 显色剂（武汉博士德公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 取液氮保存的人肝癌HepG2 细胞在37℃恒温水浴箱中快速复苏，接种于内含10%胎牛血清的RPMI-1640 培养液中常规培养，选取对数生长期细胞用于实验研究。

1.2.2 MTT 法检测细胞增殖能力 选取对数生长期的人肝癌HepG2 细胞用0.25%胰蛋白酶消化，加完全培养液制成单细胞悬液，以每孔为3×103个细胞接种于96 孔培养板中，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。培养24 h 后弃上清液，设无细胞孔作为空白组，不加药孔为对照组，实验组17-AAG 浓度为0.63、1.25、2.5、5.0 μmol/L，每组设5 个平行孔。分别温育24、48、72 h后，每孔加入20 μL 浓度为5 mg/mL 的MTT 溶液，培养4 h，吸净上清液，每孔加入150 μL 二甲基亚砜（DMSO），振荡10 min，使用酶标仪测定波长为490 nm处的吸光度值，空白组调零。细胞增殖抑制率（%）＝（对照组OD 值-实验组OD 值）/对照组OD 值×100%。 以上实验结果重复3 次。

1.2.3 PI 染色观察细胞核形态 人肝癌HepG2 细胞接种于内有重铬酸钾处理过的盖玻片的24 孔板内培养。在细胞对数生长期时设对照组和实验组培养48 h后终止，去上清液，用PBS 洗涤3 次，用50 μg/mL 的PI 荧光染液在4℃冰箱中避光染色20 min 后，夹出盖玻片盖在载玻片上，用荧光显微镜观察细胞核形态并拍照。

1.2.4 流式细胞仪分析 取对数生长期的人肝癌HepG2 细胞接种于6 孔板内培养，设实验组和对照组，培养48 h 后胰酶消化，用磷酸盐缓冲液（PBS）离心洗涤2 次。 ①细胞周期：预冷70%酒精固定，4℃过夜，离心，弃去固定液，然后加入PBS 含50 μg/mL 的PI，100 μg/mL RNase A 酶，0.2%Triton X-100 染色液，微量振荡器上振荡混匀，4℃避光孵育30 min，200 目不锈钢筛网过滤后流式细胞仪检测。 ②细胞凋亡：严格按照AnnexinV FITC 细胞凋亡检测试剂盒说明书步骤进行。 两个实验重复3 次。

1.2.5 VEGF-C 蛋白表达的检测 将人肝癌HepG2 细胞接种于内有盖玻片的6 孔板内培养培养，设对照组和实验组培养48 h 后，4%多聚甲醛固定20 min，PBS洗涤3 次，用中性树胶将细胞面朝上固定于载玻片上，采用免疫组化链霉亲和素-生物素复合物 （SABC）法染色，胰酶抗原修复，二氨基联苯胺（DAB）显色。兔抗人VEGF-C 稀释比例为1∶100，以PBS 代替一抗作为阴性对照。 结果判断：细胞胞浆出现棕黄色颗粒判断为阳性细胞，按照Fromowit 等综合计分法在高倍镜下对染色细胞着色反应作结果判定。

1.3 统计学方法

采用统计软件SPSS 17.0 对实验数据进行分析，计量资料数据以均数±标准差（）表示，采用方差分析，行t 检验。 计数资料以率表示，采用χ2检验。 以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 17-AAG 对人肝癌HepG2 细胞生长的抑制作用

MTT 测定结果显示，分别以0.63、1.25、2.5、5.0 μmol/L 4 个浓度的17-AAG 作用于人肝癌HepG2 细胞24、48、72 h 后，HepG2 细胞均有不同程度的抑制生长作用，各实验组增殖抑制率与对照组比较，差异均有统计学意义（P ＜0.05）。其抑制作用经方差分析，具有剂量和时间依赖关系，差异均有统计学意义（P ＜0.05）。见表1。

表1 不同浓度的17-AAG 对人肝癌HepG2 细胞生长的抑制率（%，）

表1 不同浓度的17-AAG 对人肝癌HepG2 细胞生长的抑制率（%，）

注：与对照组比较，#P ＜0.05；17-AAG：17-丙烯胺基-17-去甲氧格尔德霉素

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2.2 PI 染色观察凋亡细胞核形态变化

荧光显微镜下观察17-AAG 不同浓度组48 h 后PI 染色下HepG2 细胞的形态变化（图1）。 镜下细胞核呈红色荧光，对照组HepG2 细胞形态完整，细胞核大小一致，着色均匀；实验组可见HepG2 细胞体积变小，细胞核固缩，呈浓缩强荧光，并随药物浓度升高，细胞数下降，凋亡小体逐渐增多。

图1 荧光显微镜下HepG2 的细胞核染色质的形态变化（PI 荧光染色，100×）

2.3 17-AAG 对HepG2 细胞周期和凋亡的影响

流式细胞术分析显示，HepG2 细胞在17-AAG 48 h 作用下，随药物浓度的增加，G2/M 期的细胞比例增加，提示17-AAG 能使HepG2 细胞阻滞在G2/M 期，PI 染色法检测细胞周期分析结果显示， 经17-AAG作用48 h 后，不同浓度的17-AAG 均能使细胞被阻滞在G2/M 期。 细胞周期阻滞作用亦随药物浓度增加而升高。 肝癌HepG2 细胞凋亡率随着药物浓度的增加明显高于对照组细胞，与对照组比较差异有统计学意（P ＜0.05）。 见表2。

表2 17-AAG 对人肝癌HepG2 细胞周期和凋亡率的影响（%，）

表2 17-AAG 对人肝癌HepG2 细胞周期和凋亡率的影响（%，）

注：与对照组比较，＃P ＜0.05；17-AAG：17-丙烯胺基-17-去甲氧格尔德霉素

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2.4 免疫细胞化学染色法检测VEGF-C 蛋白表达结果

免疫组织化学结果显示，对照组HepG2 细胞VEGF-C 蛋白呈强阳性表达，棕黄色颗粒多，阳性细胞表达率高，见图2A。17-AAG 作用HepG2 细胞48 h后，加药细胞VEGF-C 蛋白与对照组比较，随着17-AAG 浓度的增加，表达率及表达量呈逐渐降低趋势。见图2B～E。

图2 17-AAG 处理HepG2 48 h 后VEGF-C 表达的影响（400×）

3 讨论

肝癌是严重威胁着全球人类生命健康的疾病之一。近几年，随着肿瘤分子生物学研究的深入，分子靶向药物已在多种肿瘤中进行广泛研究和应用。 HSP90是一种高度保守的具有特殊分子伴侣的功能蛋白。HSP90 可以调节下游服务蛋白的稳定性[2]。 还参与多重信号通路的调控以及细胞周期进程，在致癌信号的传导、血管的新生、抗细胞凋亡以及肿瘤转移等方面有着重要的作用[3]。 抑制HSP90 可以消耗下游服务蛋白以及影响致癌的途径，促进凋亡的发挥和抗肿瘤的效应[4]。实验证实，HSP90 抑制剂17-AAG 对白血病[5]、乳腺癌[6]、多发性骨髓瘤[7]、前列腺癌[8]等肿瘤有治疗活性，并与多数细胞毒试剂、蛋白酶体抑制剂、组蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制剂和新型靶向药物联用具有协同或增强的效果[9]。 17-AAG 通过与ATP 特异性竞争ATP/ADP 位点，使HSP90 构象改变导致效应蛋白失活，从而发挥其抑制生长，促进凋亡的作用[10]。 17-AAG还可诱导Flt3-ITD 的降解[11]，对有Flt3-ITD 的突变AML 患者有望改善其预后。 实验MTT 结果表明，HSP90 抑制剂17-AAG 对肝癌HepG2 细胞有抑制生长的作用，抑制作用随着作用时间、药物浓度的增加而增强。通过PI 荧光染色，观察到17-AAG 作用过的HepG2 细胞数减少，细胞核着色由大小均一变成体积小而深，并出现凋亡小体，提示17-AAG 对HepG2 细胞有抑制增殖并诱导凋亡的作用。本次试验通过细胞流式检测，提示17-AAG 的体外抑制可能与阻滞HepG2 细胞在G2/M 期，并促进凋亡有关。

血管内皮生长因子（VEGF）具有促进恶性肿瘤的增殖、侵袭和转移的作用。 VEGF-C 是VEGF 家族中最早被发现的促淋巴管生成因子，与其受体VEGFR-3结合后促进淋巴管内皮细胞的生长，主要为三条通路：①VEGF-3 胞内的区酪氨酸Y1230/Y1231，发生自磷酸化、被识别、结合，通过诱导活化CRB2/ERX1/2和PI13K/AKT 信号通路，启动DNA 复制，诱导内皮细胞增生；②VEGFR-3 酪氨酸残基Y1063 发生磷酸化，诱导活化CRKⅠ/Ⅱ和c-Jun 氨基末端激酶Gnk1/2，引起细胞内信号级联反应的信号； ③通过蛋白激酶C（PKC）依赖的p42/p44 MAPK 活化途径和PI3K/AKT磷酸化产生的信号[12]。 VEGFR-3 通过与VEGF-C 结合后，还调节血管渗透性，促进肿瘤组织进入淋巴管，抑制凋亡，导致肿瘤的高转移率的发生[13]。 有研究报道HSP90 抑制剂根赤壳菌素类可以抑制VEGF 的表达[14]，17-AAG 可以通过阻断STAT3 通路抑制胃癌和乳腺癌细胞VEGF 的表达[15]。 本实验研究结果表明，VEGF-C 在人肝癌HepG2 细胞对照组中处于高表达，一定剂量的17-AAG 可以明显下调VEGF-C 蛋白的表达。 提示VEGF-C 蛋白参与了肝癌细胞增殖及转移的相关生物学行为的调控，17-AAG 可以通过下调VEGF-C 蛋白的表达抑制淋巴管的生成，可能是17-AAG 抑制肝癌的机制之一。

总之，本次实验证实了HSP90 抑制剂17-AAG能够抑制肝癌HepG2 细胞的增殖，诱导凋亡，并通过下调VEGF 蛋白阻碍肿瘤的侵袭。由于17-AAG 发挥抗肿瘤的机制很多，还需进一步研究，为肝癌临床上的应用提供实验依据。

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