载神经生长因子纳米柔性脂质体制备及稳定性研究

管晨峰 路伟 张开礼 郭见 潘一峰 黄国栋

神经生长因子(nerve growth factor，NGF)在损伤神经再生和功能修复过程中发挥重要作用。然而，NGF难以通过血脑屏障，使其在给药的途径和方式上存在技术上的难题。纳米柔性脂质体具有高度的变形性，它能穿过直径为其1/10的小孔。本研究采用薄膜-超声法制备载NGF纳米柔性脂质体，并对制备条件和稳定性进行研究。

1 材料与方法

1.1 仪器RE-52旋转蒸发器(上海青浦沪西仪器厂);WH-2微型漩涡混合仪(上海沪西分析仪器厂);超声破碎乳化仪;SHZ-Ⅲ型循环水真空泵(上海亚荣生化仪器厂);Zetasizer激光粒度分析仪(英国马尔文公司)。

1.2 主要试剂 葡聚糖凝胶G-50(上海伯奥生物科技有限公司);卵磷脂、胆固醇、胆酸钠(国药集团化学试剂有限公司);NGF(厦门北大之路生物工程有限公司)。

1.3 载NGF纳米柔性脂质体的制备 定量称取卵磷脂、胆固醇、NGF于圆底烧瓶中，加入10 ml氯仿-甲醇复合溶剂于混合仪上充分溶解后，于37℃恒温水浴中旋转减压蒸发去除有机溶剂，形成均匀类脂薄膜，以氮气吹干残余溶剂。再加入含有定量胆酸钠的水和介质溶液10 ml至烧瓶中，旋转洗膜1 h，使脂质膜充分溶胀水化，得到脂质体混悬液。将上述脂质体混悬液置于冰水浴中探针式间断超声，室温静置后用0.2 μm微孔滤膜过滤除去超声时探头所释放的金属颗粒等杂质。氮气密封，4℃冷藏保存。

1.4 载NGF纳米柔性脂质体包封率测定 取适量的载NGF纳米柔性脂质体，加5%Tri-ton X-100乙醇溶液2 ml破乳，再加入5 ml磷酸盐缓冲液充分混匀，萃取，静置，Elissa法测定NGF含量。包封率=总NGF量-游离NGF量/总NGF量×100%。

1.5 载NGF纳米柔性脂质体粒径检测 加样枪吸取适量脂质体样品溶液，注入到激光粒度分析仪的石英测量池和毛细管小池中，进行粒径检测。

1.6 统计学分析 应用SPSS 11.5统计软件，计量资料以±s表示，采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 制备温度的影响 在20～50℃范围对制备温度进行了筛选。结果表明，30℃时，制备的纳米脂质体包封率最高。见表1。

表1 制备温度对包封率的影响±s

表1 制备温度对包封率的影响±s

20℃30℃40℃50℃包封率(%)40.24±0.2261.52±0.4354.26±0.4633.52±0.27项目

2.2 pH值对包封率的影响 配制pH值分别为6.0，6.5，7.0，7.5，8.0的缓冲液，以它们作为水相介质，制备载NGF纳米柔性脂质体。pH值为7.0时，制备的纳米脂质体包封率最高。见表2。

表2 pH值对包封率的影响±s

表2 pH值对包封率的影响±s

8.0包封率(%)37.04±0.4441.26±0.3760.13±0.62 50.14±0.4项目pH值6.0pH值6.5pH值7.0pH值7.5pH值932.71±0.68

2.3 磷脂浓度对包封率的影响 考察磷脂的浓度分别为20、30、40、50 mg/ml时，磷脂浓度对药物包封率的影响。磷脂浓度对药物的包封率影响较大。磷脂浓度增加，包封率上升，当磷脂浓度达到40 mg/ml时，包封率变化不多。见表3。

表3 磷脂浓度对包封率的影响±s

表3 磷脂浓度对包封率的影响±s

20 mg/ml30 mg/ml40 mg/ml50 mg/ml包封率(%)23.61±0.1442.30±0.6357.86±0.7260.05±0.67项目

2.4 胆固醇与磷脂的比例对包封率的影响NGF药量固定，改变胆固醇的浓度，使胆固醇与磷脂的比例为1∶10，1∶8，1∶6，1∶4，1∶2。随着胆固醇浓度的增加，包封率也相应的增加，当比值达到1∶4时，包封率趋于稳定。见表4。

表4 胆固醇与磷脂的比例对包封率的影响±s

表4 胆固醇与磷脂的比例对包封率的影响±s

1∶2包封率(%)22.16±0.2035.36±0.2540.72±0.5462.02±0.6项目 胆固醇与磷脂比1∶10胆固醇与磷脂比1∶8胆固醇与磷脂比1∶6胆固醇与磷脂比1∶4胆固醇与磷脂比365.30±0.62

2.5 载NGF纳米柔性脂质体稳定性观测 在室温条件下，30 d内载NGF纳米柔性脂质平均粒径无显著改变。同时，在4℃冰箱条件下保存12个月，上述指标的检测结果与保存前相似。见表5。

表5 载NGF纳米柔性脂质体稳定性观测±s

表5 载NGF纳米柔性脂质体稳定性观测±s

室温4℃下保存时间(月)项目12平均粒径(nm)64.31±0.8362.17±0.6460.64±0.7264.3±0.83 0 d15 d30 d 06 59.58±0.4958.72±0.56

3 讨论

NGF作为现在临床上应用比较普遍的体液调节因子之一，广泛的分布于中枢神经及周围神经系统中。它通过促进神经系统的发育，维持神经元的生长、存活、分化，并影响突触的可塑性。病理状态下，NGF可抑制神经元的死亡，加强自由基的清除，促进神经元功能的恢复，达到保护神经元的目的。然而，由于NGF属大分子蛋白质，正常情况下难以通过血脑屏障，限制其临床应用［1-4］。

柔性脂质体是指在脂质体的双分子层中加入不同的柔软剂使脂质体具有优越的柔顺性和变形性，易于携带药物通过微孔道，而且，柔性脂质体对药物的包封率高于普通脂质体，其稳定性也远远大于普通脂质体。纳米级的柔性脂质体则具有更高的穿透效率［5-9］。

影响脂质体中药物包封率有多种因素，如:温度、溶液pH、磷脂浓度、胆固醇与磷脂的比例等，本文较系统地考察了各影响因素对神经生长因子纳米柔性脂质体包封率的影响及其稳定性。

试验结果表明，制备载NGF纳米柔性脂质体的最适温度为30℃;pH值为7.0时，制备的纳米脂质体包封率最高。磷脂浓度增加，包封率上升，适宜浓度为40 mg/ml;磷脂与胆固醇相互间隔定向排列，形成双分子层，是共同构成脂质体的基础物质，本文的研究显示，胆固醇与磷脂适宜比例为1∶4。

对载NGF纳米柔性脂质体稳定性的研究表明，其性质稳定，室温保存30 d、4℃冰箱12个月，其粒径无明显变化。

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