淫羊藿配合髓芯减压术治疗兔激素性股骨头坏死的实验研究

刘志国 马文海 李杰

股骨头坏死(femoral head necrosis)是由不同病因引起的股骨头活力成分死亡的病理过程，临床以髋关节疼痛、功能障碍为主要症状。该病起病隐匿，病程长，预后差，一旦发生塌陷，多发展为髋关节的退行性关节病，是骨科治疗上的疑难重症。激素性股骨头坏死(steroid-induced femoral head necrosis)是肾上腺皮质类固醇药物性股骨头坏死的简称，为非创伤性股骨头坏死中最为常见的类型，随着临床大量激素药物的应用，其发病率呈逐年升高的趋势。目前，手术与中医药治疗各有利弊，探讨如何将西医手术和中医药的治疗优势有机结合，寻求一种疗效确切，费用低廉，副作用少的综合疗法，对于提高治疗激素性股骨头坏死的疗效，减轻患者和社会经济负担具有重要意义。本研究应用中药淫羊藿配合髓芯减压术治疗动物激素性股骨头坏死，观察该疗法对股骨头骨组织再生的影响，揭示其治疗激素性股骨头坏死的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 纯种健康成年雄性新西兰大白兔60只，年龄5～6个月，体重2.5～3.5 kg，由白求恩国际和平医院动物实验室提供［批号:SYXK-(军)2012-017］，屏蔽环境饲养。

1.2 主要仪器及试剂 马血清(北京元亨圣马生物技术研究所)，甲基强的松龙(美国辉瑞生物制药公司)，中药淫羊藿成品(贵州同仁堂药业有限公司)，Trizol试剂、RIPA裂解液、BCA蛋白定量试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)，PCR引物(上海生工)，逆转录试剂盒(MBI Fermentas公司)，兔抗BMP-2多克隆抗体和兔抗IGF1多克隆抗体(武汉博士德生物工程有限公司)，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG抗体(sigma公司，美国)，OMNI TH组织均质仪(美国OMNI公司)，PCR仪(德国Effendorf公司)，水平电泳仪(美国Bio-Rad公司)，垂直电泳仪(北京市六一仪器厂)，半干电转仪(北京君意东方电泳设备有限公司)，柯达计算机X线摄影成像系统(900 CR)，Lunar prodigy型双能X线骨密度仪(美国GE公司)，INSTRON 5544材料性能实验机(美国instron公司)。

1.3 方法

1.3.1 动物模型制作及分组:将动物随机分为对照组(n=12)和模型组(n=48)。按照Wang等［1］造模方法造模，兔耳缘静脉注射马血清10 ml/kg，间隔3周后，马血清量减为6 ml/kg，经兔耳缘静脉再次注射，间隔2周后，腹腔注射甲基强的松龙45 mg/kg，1次/d，连续3 d。注射激素期间，每只动物每次腹腔注射青霉素10万U，1次/d，连续7 d，预防感染。经X线检测证实造模成功后，将模型动物随机分为模型组、手术组(髓芯减压术)、中药组(淫羊藿)、综合组(随芯减压术+淫羊藿)，每组12只。

1.3.2 动物处理:手术组:采用髓芯减压术治疗。俯卧于手术台上，局部备皮后消毒，沿大转子切开皮肤皮下，分离肌肉及骨膜，在大转子上用2 mm细钻头向股骨头内钻孔，以不越过股骨头软骨面为界。彻底清除髓腔后关闭切口，术后肌内注射青霉素10万U预防感染，1次/d，共1周。中药组:将淫羊藿加水文火煎熬至生药质量浓度为1 g/ml，每天给予淫羊藿熬制液6 ml/kg喂养，观察其均能在10 min内喝完，连续8周。综合组:在做髓芯减压术的基础上配合喂养淫羊藿。

术后10周末，将所有动物氯胺酮复合麻醉后，备皮、消毒、固定。严格无菌手术下，取出双侧股骨头，经DEPC处理的PBS液冲洗后，一侧股骨头放入液氮中冻存，用于PCR及Western blot检测。另一侧用于生物力学检测。

1.3.3 X线检查:于最后1次激素注射后4周末，2组各取6只动物，氯胺酮复合麻醉(安定3.5 mg/kg肌内注射15 min后，氯胺酮25 mg/kg肌内注射)后，拍双髋正位X线片。

1.3.4 生物力学检测:将股骨头标本固定在材料性能实验机的夹具内垂直加压。平稳加载速度控制在2 mm/min，实验仪内的计算机自动记录位移应变等数据由Merlin软件实验检测系统采集。

1.3.5 RT-PCR:采用高速均质仪进行组织粉碎处理，按Trizol试剂盒的说明要求，提取总RNA，并用DNA酶处理总RNA，琼脂糖凝胶电泳确定RNA未降解，紫外分光光度计测定浓度。使用RT试剂盒，将RNA反转录为cDNA，进行PCR扩增，产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测基因的表达。目的基因检测所用引物见表1。

表1 目的基因检测所用引物

1.3.6 Western blot:于粉末状骨组织中加入PIPA裂解液，提取总蛋白，BCA法测定浓度，取等量蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳，随后将蛋白电转至PVDF膜上。膜先在5%脱脂牛奶中室温封闭1 h，加入一抗(IGF1 1∶200;BMP-2 1∶500稀释)，4℃杂交过夜。将膜转移到辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体中(1∶10 000稀释)，室温杂交1 h。将膜置于化学发光液中，曝光、显影及定影。

1.4 统计学分析 应用SPSS 13.0统计软件，计量资料以±s表示，行单因素方差分析(One-way ANOVA)，组间比较采用独立性t检验，两变量之间的关系采用相关分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 X线检查结果 正常对照组股骨头形态完整，关节面清晰，股骨头骨密度均匀;模型组股骨头关节面模糊，可见骨密度减低，囊性变，骨硬化等表现。见图1。

图1 2组注射激素后4周双侧X线表现

2.2 IGF1和BMP-2 mRNA、蛋白的表达IGF1mRNA和蛋白水平，模型组显著高于对照组(P＜0.05)，可能是机体的自发修复反应促使其表达升高。BMP-2 mRNA和蛋白水平，模型组较对照组明显下降(P＜0.05)。IGF1、BMP-2 mRNA和蛋白的表达，中药组与综合组，手术组与模型组比较差异均无统计学意义(P＞0.05);而两者在中药组和综合组的表达显著高于模型组和手术组(P＜0.05)。并且，IGF1与BMP-2 mRNA(r=0.706，P＜0.01)及蛋白(r=0.792，P＜0.01)在股骨头的表达呈明显正相关。见表2、3，图2、3。

表2 股骨头骨组织中IGF1/GAPPH和BMP-2mRNA的表达情况n=12，±s

表2 股骨头骨组织中IGF1/GAPPH和BMP-2mRNA的表达情况n=12，±s

注:与对照组比较，*P＜0.01;与模型组比较，#P＜0.01;与手术组比较，△P＜0.01

组别BMP-2/GADPHmRNAIGF1/GADPHmRNA模型组0.769±0.093*1.029±0.082*1.491±0.0820.563±0.067手术组0.876±1.107*1.057±0.093*中药组1.164±0.104*#△1.301±0.087*#△综合组1.157±0.096*#△1.387±0.095*#△对照组

表3 股骨头骨组织中PFGH和BMP-2蛋白的表达情况n=12，±s

表3 股骨头骨组织中PFGH和BMP-2蛋白的表达情况n=12，±s

注:与对照组比较，*P＜0.01;与模型组比较，#P＜0.01;与手术组比较，△P＜0.01

组别IGF1/GADPH蛋白BMP-2/GADPH 蛋白模型组0.551±0.091*0.437±0.082*0.419±0.0830.959±0.093手术组0.578±0.089*0.453±0.078*中药组0.845±0.103*#△0.705±0.103*#△综合组0.907±0.107*#△0.737±0.099*#△对照组

图2 RT-PCR检测股骨头组织中IGF1和BMP-2mRNA的表达

图3 Western blot检测股骨头骨组织中IGF1和BMP-2蛋白的表达

2.3 骨密度 与对照组比较，模型组骨密度明显下降(P＜0.01)。中药组、手术组、综合组均较模型组有所改善(P＜0.05或＜0.01)，其中综合组改善效果明显好于中药组和手术组(P＜0.05)。见表4。

表4 5组股骨头骨密度的改变n=12，g/cm2，±s

表4 5组股骨头骨密度的改变n=12，g/cm2，±s

注:与对照组比较，*P＜0.05，#P＜0.01;与模型组比较，△P＜0.05，☆P＜0.01;与综合组比较，▲P＜0.05

组别 骨密度值综合组0.265±0.021＊☆0.276±0.027中药组0.229±0.025#△▲手术组0.215±0.029#△▲模型组0.161±0.023#对照组

2.4 生物力学测定结果 与对照组比较，模型组骨结构力学参数抗压强度、刚度均明显下降(P＜0.05或＜0.01);中药组、手术组、综合组均较模型组有不同程度改善(P＜0.05或＜0.01)，其中综合组改善效果明显好于中药组和手术组(P＜0.05)。见表5。

表5 5组生物力学参数测定n=12，±s

表5 5组生物力学参数测定n=12，±s

注:与对照组比较，*P＜0.05，#P＜0.01;与模型组比较，△P＜0.05，☆P＜0.01;与综合组比较，▲P＜0.05

组别 抗压强度(N)刚度(N/mm)综合组922±109＊△839±66＊☆964±117882±64中药组860±122＊△▲741±72#△▲手术组836±133＊△▲726±58#△▲模型组778±128*672±50#对照组

3 讨论

激素性股骨头坏死占非创伤性股骨头坏死的首位，并有逐年增高的趋势。建立股骨头坏死的动物模型对探索成功的治疗模式是必不可少的。用马血清致动物出现Ⅲ型变态反应，即抗原抗体复合物沉积在血管壁上引起超敏性血管炎，此后应用糖皮质激素可抑制胶原和弹性纤维的合成，进而导致小动脉断裂或栓塞，髓内出血，最终导致股骨头坏死。同时，激素诱导骨髓脂肪化，脂肪细胞增生肥大，成骨细胞减少，髓内压升高，血管受压，脂肪损害血管内皮细胞，局部血栓形成，或脂肪栓塞进一步导致骨坏死的发生。本实验参照Wang等［1］的方法，用改进的马血清加甲基强的松龙的方法诱导制备兔激素性股骨头坏死动物模型，其影像学改变符合临床典型的股骨头坏死的特征，且具有简便、动物死亡率低、成功率高等优点。

近年研究者发现胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor-1，IGF-1)是骨基质中的重要生长因子之一，其作为一种自分泌调节因子而影响骨骼形成和成骨细胞的功能，它们可由骨骼细胞分泌，具有调节骨保护素，抑制破骨细胞的分化成熟，减少骨吸收，系统调节促进骨形成和骨吸收的偶联，加速骨转化的作用。IGF1还可刺激骨骼Ⅰ型胶原蛋白合成及加快骨基质的沉积速度，降低骨胶原蛋白的分解和抑制胶原蛋白酶的合成，有效促进骨细胞的有丝分裂和成骨细胞的功能分化，增强碱性磷酸酶活性和钙盐沉着［2］。同时，IGF1对软骨细胞形态发生和有丝分裂以及功能代谢都有广泛影响［3］。骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)是目前应用最多的一类促骨生长因子。其中BMP-2是公认的最主要的骨形成调控因子，其诱导成骨的生物学作用和长期效果也已被证实。近年研究发现，BMP-2的表达受多种因子的调节，如王霖霞等［4，5］以不同浓度的IGF1刺激分离培养的大鼠成骨细胞，发现IGF1可在转录水平增加大鼠成骨细胞中BMP-2基因的表达，并呈明显的剂量依赖关系，我们通过检测兔激素性股骨头坏死治疗前后IGF1、BMP2 mRNA及蛋白的表达，发现两者表达呈明显正相关，由此推测在骨修复过程中，IGF1对BMP2的表达可能具有正向调节的作用。

髓芯减压术(core decompression)作为治疗股骨头缺血性坏死的一种方法已有三十余年的历史。其通过降低骨内高压，排出坏死组织，刺激加压孔周围的血管形成，增强坏死骨的爬行替代，使坏死灶得以消除。但研究认为，Ⅰ期患者经过随芯减压治疗后，临床效果好，Ⅱ期治疗应慎重，Ⅲ期治疗效果不好［6］。髓芯减压术只能缓解疼痛的症状，一旦发生股骨头坏死，它的病理过程将持续发展，最终全髋置换术将不可避免。我们研究发现，髓芯减压术后，IGF1和BMP-2的表达没有发生改变。可见，单纯髓芯减压术并不能缓解激素对坏死骨组织自我修复的抑制作用，因此仍有一定的局限性，若能结合其他促进股骨头隧道内血管再生及骨形成的治疗，必将加快股骨头的修复，提高疗效并扩大适应证。中药淫羊藿具有温肾壮阳、强筋骨、祛风湿的功能，广泛应用于肾虚所致的腰膝酸软、筋骨衰弱失用等，其主要化学成分为黄酮类化合物、木脂素及生物碱，其中淫羊藿总黄酮主要参与骨代谢，具有促进体外成骨细胞增殖及分化成熟，抑制破骨细胞的活性，从而达到治疗骨质疏松的作用。王欣文等［7］通过X线摄片、骨密度测定、生物力学测试以及组织学切片证实，淫羊藿促进家兔骨折愈合效果明显，与BMP-2的效果相当。在治疗激素性股骨头坏死方面，研究发现，淫羊藿可以降低血液流变学的各项指标、保证组织有效灌注、改善股骨头的局部微循环［8］;降低血液内三酰甘油和总胆固醇的水平，有效改善股骨头内环境，促进损伤修复［9］;有效抑制皮质激素对OPG/RANKL/RANK系统的影响，使OPG/RANKL比值接近正常，阻止由于OPG/RANKL表达异常导致的破骨细胞异常活化［10］。我们研究发现，中药组与模型组，综合组与手术组相比，IGF1和BMP-2表达明显升高，骨密度及抗压力均有所增加，提示淫羊藿通过上调IGF1和BMP-2的表达而加快激素性股骨头坏死的修复。

综上，我们可知随芯减压术可以缓解疼痛，延缓骨坏死的进展，但不能很好地促进坏死骨组织的自我修复，而中药淫羊藿可促进骨生长，加快修复。淫羊藿配合随芯减压术可以利弊互补，有效增加股骨头骨密度，提高骨强度，阻止股骨头变形，为临床上治疗激素性股骨头坏死提供了一种较为有效的方法。

1 Wang Wei，Wang Kunzheng，Liu Liying，et al.The dynamic expression of PPARγ and BMP2 in the setroid-induced osteonecrosis of femoral.Chinese Journal of Orthopaedics，2008，28:327-332.

2 浮煜，贺西京，王宇强，等.仙仲注射液对兔早期膝关节炎形态学及胰岛素样生长因子-1的影响.中国中西医结合杂志，2007，27:237-240.

3 Abdallah BM.Osteoblast differentiation of NIH3T3 fibroblasts is associated with changes in the IGF-I/IGFBP expression pattern.Cell Mol Biol Lett，2006，11:461-474.

4 王霖霞，李玉坤.BMP-2信号通路与成骨细胞分化.国际骨科学，2009，30:132-136.

5 梁冬春，王宝利，左爱军，等.胰岛素样生长因子1对成骨细胞中BMP2、BMP7基因表达的影响.中国骨质疏松杂志，2004，10:45-47.

6 Aigner N，Schneider W，Eberl V，et al.Core decompression in early stages of femoral head osteonecrosis-an MRI controlled study.Int Orthop，2002，26:31-35.

7 王欣文，何爱咏，蔡羽中，等.淫羊藿及骨形态发生蛋白2与家兔的骨折愈合.中国组织工程研究与临床康复，2011，15:2030-2033.

8 李慧英，王义生.淫羊藿对激素性股骨头坏死大鼠血液流变学及骨密度的影响.中华实验外科杂志，2012，29:1226-1228.

9 李慧英，孟东方.淫羊藿提取液对激素性股骨头坏死的作用.中国组织工程研究与临床康复，2010，50:9395-9398.

10 王建忠，高鸿雁，王坤正，等.淫羊藿对激素性股骨头坏死骨组织OPG/RANKL mRNA表达的影响.南方医科大学学报，2011，31:1714-1717.