家兔下腔静脉血栓模型建立的实验研究

吴大勇 张文艳 陈江红 边艳珠 胡玉敬

肺动脉血栓栓塞(pulmonary thromboembolism，PTE)和深静脉血栓形成(deep venous thrombosis，DVT)是静脉血栓栓塞(venous thromboembolism，VTE)的两种临床表现，具有相同的易患因素［1］。PTE的病死率高，严重危害人类健康。DVT是PTE的主要血栓来源。近端深静脉存在血栓的患者中，约50%患者伴有临床无症状的PTE［2］。70%的PTE患者在下肢深静脉发现血栓［3］。DVT的早期诊断及有效治疗对预防PTE发生具有重要意义。DVT诊断及治疗的动物实验研究离不开静脉血栓模型，静脉血栓动物模型是DVT实验研究的关键一环。静脉血管内引入异物，通过异物启动凝血过程，可在异物表面附着形成血栓;异物能够导致血流淤滞，局部血液形成涡流，促进凝血;同时异物在静脉血管内损伤血管内膜，暴露胶原组织，启动内源性凝血过程促进血栓形成［4］。本实验选用家兔下腔静脉，对利用异物法建立下腔静脉血栓模型进行研究。

1 材料与方法

1.1 材料 清洁级新西兰家兔30只，体重2.0～2.5 kg，雌雄不限，购自河北医科大学实验动物中心，合格证编号:1009032。3%戊巴比妥钠注射液河北医科大学药学院惠赠。青霉素购于石家庄制药厂。

1.2 方法

1.2.1 实验动物分组:将30只实验兔分为血栓组25只，对照组5只。血栓组建立下腔静脉血栓模型，对照组仅进行造模术相同的手术过程，但不建立血栓模型。

1.2.2 实验动物麻醉:由实验兔耳缘静脉注射3%戊巴比妥钠，注射剂量为1.0～0.3 ml/kg，麻醉成功后，仰卧位四肢伸展固定于手术台。

1.2.3 血栓组下腔静脉血栓造模方法:实验兔右侧腹备皮，沿腹直肌右外侧线切开皮肤长约4～6 cm切口，逐层钝性分离腹壁肌肉、腹膜。入腹腔后将肠管部分移出，用0.9%氯化钠溶液浸湿纱布覆盖肠管，充分暴露右肾下极水平以下下腔静脉。将自制U形铜丝夹于右肾下极水平包绕下腔静脉，长约3 cm直径约3 mm的自制单股螺旋铜丝向心方向穿刺入下腔静脉，止血后，将铜丝夹收紧使夹子缝隙约2 mm左右。回纳肠管，0.9%氯化钠溶液冲洗腹腔，逐层缝合腹膜、肌肉、皮肤。手术完毕后于实验兔臀部肌内注射80万U青霉素。家兔术后清洁环境饲养。

1.2.4 对照组手术方法:对照组进行与血栓组相同的手术过程，只是不在下腔静脉内穿刺置入自制螺旋铜丝，及在下腔静脉不放置自制U形铜丝夹。

1.2.5 解剖:血栓组与对照组均于手术后1 d，注射致死量戊巴比妥钠处死实验兔，解剖实验兔，血栓组观察血栓形成情况，对照组观察下腔静脉情况。

1.2.6 病理:血栓组处死动物后取血栓，0.9%氯化钠溶液冲洗干净，纱布粘干，立即至于甲醛溶液中固定，后血栓标本经石蜡包埋，切片，行苏木精-伊红(HE)染色。

2 结果

血栓组25只实验兔造模术后均存活，一般情况良好。造模术后1 d处死实验兔解剖后，所有25只实验兔下腔静脉管壁完好，未见破裂出血。23只实验兔下腔静脉内肉眼可见血栓形成(图1)，红色血栓与白色血栓沿螺旋铜丝相间附着(图2)，下腔静脉回流尚通畅，造模成功率92%(23/25)。2只实验兔未观察到下腔静脉血栓形成，下腔静脉回流通畅，系由于自制U形铜丝夹脱落，螺旋铜丝沿下腔静脉随血流上行嵌顿于右心房。

对照组5只实验兔术后均存活，一般情况良好。术后1 d处死实验兔解剖后观察，可见下腔静脉均回流通畅，下腔静脉内未见血栓形成(图1)。

血栓组血栓病理证实均为新鲜混合血栓(图2)，红色血栓与白色血栓间或存在，病理切片经HE染色，显微镜下见淡红色珊瑚状血小板小梁，小梁间纤维素网内包含大量红细胞，血小板小梁边缘有较多中性粒细胞粘附。

图1 血栓组与对照组解剖后下腔静脉照片

图2 血栓大体标本与病理照片

3 讨论

DVT是血液在深静脉内异常凝集导致的静脉血液回流障碍性疾病，静脉血栓脱落阻塞肺动脉便引起PTE，PTE严重者影响患者生活质量甚至导致死亡。DVT是临床多发的一种疾患，主要成因为静脉血管壁损伤、血流缓慢和血液高凝状态，常继发于长时间静坐、长期卧床、肢体制动、大手术创伤后或晚期肿瘤患者［5］。对DVT诊断或治疗的研究对于预防PTE具有重要意义，静脉血栓动物模型的建立是对DVT诊断或治疗进行实验研究的基础。

研究报道中血栓模型的常用造模方法有三种。(1)通过损伤血管内膜暴露内膜下胶原激活凝血过程［6-8］。常见方法为在DSA下将导管穿刺插入血管，通过抽拉导丝或球囊来损伤血管内膜，此方法内膜损伤效果好，但需用到DSA机及需要导管介入操作技术，对于一般实验小组较难实现。另也可手术暴露深静脉利用血管钳夹压静脉血管来损伤血管内膜［9，10］，但通过血管外加压损伤血管内膜的效果差。(2)人为制造血管局部血流淤滞导致凝血［11］。常见方法为手术暴露静脉血管利用手术缝线结扎血管，造成局部血液淤滞。血液淤滞形成的血栓多为红色血栓，人类形成的静脉血栓早期及中期多为混合血栓，只有在混合血栓阻塞血管后，在血栓尾端才形成红色血栓［12］。张鹏等［13］利用导管介入技术通过球囊加压阻塞血管，建立的犬下肢深静脉血栓模型，血栓病理显示以红色血栓为主。(3)通过血管内置入异物启动凝血过程。目前已有多篇报道［14］通过导管介入技术，将螺旋铜丝等异物置入静脉血管建立血栓模型的报道。Wei等［15］利用导管将自制螺旋铜丝送入犬股静脉，成功建立了股静脉血栓模型。上述方法需利用DSA机及需要介入操作技术，一般科研人员较难实现。

本研究通过手术暴露下腔静脉，将自制螺旋铜丝穿刺置入下腔静脉，螺旋铜丝为异物激活凝血过程，也导致局部血流缓慢，另螺旋铜丝刺激损伤局部血管黏膜，启动内源性凝血过程，促进血栓形成。于螺旋铜丝近心端下腔静脉血管放置自制U形铜丝夹，固定螺旋铜丝，同时起到部分阻断血流，导致局部血流瘀滞的作用，也利于血栓形成。该方法具有较高的成功率，实验中成功建立下腔静脉血栓模型23只，成功率92%(23/25)。造模术后1 d，实验兔下腔静脉内螺旋铜丝可见红白相间沿铜丝分布的混合血栓。HE染色病理证实了血栓均为混合血栓。

文献报道中常用于造模的动物有犬、家兔及大鼠。犬的血管较粗，容易操作，但价格昂贵;大鼠价格低廉，但血管较细，不容易操作，手术或介入方法都难度较大;家兔的下腔静脉较粗，且价格适中，大样本量的实验是较合适的选择。

本方法造模成功率高，血栓病理符合深静脉血栓特点，所建立静脉血栓模型可以用于静脉血栓的影像诊断、溶栓治疗及病理生理等研究，本方法无需借助DSA等大型仪器设备，也未利用导管介入技术等高难度操作，一般的科研工作人员较易独立完成。

1 Torbicki A，Perrier A，Konstantinides S，et al.Guidelines on the diagnosis and management of acute pulmonary embolism:the Task Force for the Diagnosisand Management of Acute Pulmonary Embolism of the European Society of Cardiology(ESC).Eur Heart J，2008，29:2276-2315.

2 Moser KM，Fedullo PF，Littejohn JK，et al.Frequent asymptomatic pulmonary embolism in patients with deep venous thrombosis.JAMA，1994，271:223-225.

3 Kearon C.Natural history of venous thromboembolism.Circulation，2003，107(23 Suppl.1):122-130.

4 Drffler-Melly J，Schwarte LA，Ince C，et al.Mouse models of focal arterial and venous thrombosis.Basic Res Cardiol，2000，95:503-509.

5 李小强，王深明.深静脉血栓形成的诊断和治疗指南(第2版).中华外科杂志，2012，50:611-614.

6 Konishi H，Katoh Y，Takaya N，et al.Platelets activated by collagen through immunoreceptor tyrosine-based activation motif play pivotal role in initiation and generation of neointimal hyperplasia after vascular injury.Circulation，2002，105:912-916.

7 Massberg S，Gawaz M，Gruner S，et al.A crucial role of glycoprote in VI for platelet recruitment to the injured arterial wall in vivo.J Exp Med，2003，197:41-49.

8 贾支俊，申景涛，郭万华，等.99Tcm标重组H-AnnexinV在动物血栓显像中的研究.中华核医学杂志，2007，27:291-294.

9 Massberg S，Brand K，Gruner S，et al.A critical role of platelet adhesion in the initiation of atherosclerotic lesion formation.J Exp Med，2002，196:887-896.

10 Gruner S，Prostredna M，Aktas B，et al.Antiglycoprotein VI treatment severely compromises hemostasis in mice with reduced alpha2beta1 levels or concomitant aspirin therapy.Circulation，2004，110:2946-2951.

11 Trerotola SO，McLennan G，Davidson D，et al.Preclinical in vivo testing of the Arrow-Trerotola percutaneous thrombolytic device for venous thrombosis.J Vasc Interv Radiol，2001，12:95-103.

12 Furie B，Furie BC.In vivo thrombus formation.J Thromb Haemostasis，2007，5(Suppl.1):12-17.

13 张鹏，施海彬，刘圣，等.犬下肢深静脉血栓模型的实验研究.介入放射学杂志，2006，15:299-302.

14 何嘉，方纬，王峰，等.99Tcm-DMP444肺动脉血栓与下肢深静脉血栓显像的实验研究.中华核医学与分子影像杂志，2012，32:59-62.

15 Wei Fang，Jia He，Young-Seung Kim，et al.Evaluation of 99mTc-Labeled Cyclic RGD Peptide with a PEG4 Linker for Thrombosis Imaging:Comparison with DMP444.Bioconjugate Chemistry，2011，22:1715-1722.