不同固定方法制作大鼠眼球组织石蜡切片的比较

张亚楠，王子鸣，任广伟，李 航，郭浅妤，张 雷*

(1.河北医科大学基础医学院组织学与胚胎学教研室，河北 石家庄 050017；2.河北医科大学第一医院肾内科，河北 石家庄 050031)

眼球是一种构造复杂的器官，其各部位的结构和密度不同，且各层次间的依附性和连接性较差[1]。大鼠眼球组织的石蜡切片被广泛应用于眼科相关疾病的实验研究，而常规石蜡切片方法极易造成眼球变形，各层次之间结构分离、移位，特别是固定液性的视网膜脱落，给组织病理学的诊断带来很大的阻碍。对此，我们结合眼球的结构特点及以往的文献报道[1-10]，比较了3种不同的固定方法，总结出较适合制作大鼠眼球石蜡切片的固定方法，有效地提高了大鼠眼球石蜡切片的质量，现介绍如下。

1 材料与方法

1.1 材料：动物，Sprague-Dawley(SD)大鼠，15只，雌雄不限，2～4周龄，体质量100g，购于河北省实验动物中心。按照不同的固定方法分为A组，10只眼球，用固定液1固定；B组，10只眼球，用固定液2固定；C组，10只眼球，用固定液3固定。固定液1，体积分数95%乙醇85mL，体积分数10%中性甲醛10mL，冰醋酸5mL充分混匀[2]。固定液2，多聚甲醛4g加入0.1mol/L磷酸缓冲液100mL，加热至60℃左右，使粉末完全溶解。固定液3，多聚甲醛4g加入0.1mol/L磷酸缓冲液80mL，加热至60℃左右，持续搅拌，使粉末完全溶解，加少许1mol/L氢氧化钠澄清。待冷却后，加冰醋酸5mL、丙酮10mL，用0.1mol/L磷酸缓冲液补足至100mL[3]。

1.2 方法

1.2.1 取材与固定：将SD大鼠脱颈处死后，用无齿眼科镊摘除眼球，保留约5mm的视神经，用角巩膜剪剪去眼球周围组织[4]，按照上述分组方法用不同固定液分别固定3组眼球，在固定4～5h后，用1mL注射器抽取3组各自的固定液由角巩膜缘向眼球内注射入少量固定液。所有标本在固定24h后，用蒸馏水冲洗3次，每次30min。随后分别在体积分数为55%、65%、75%、85%、95%乙醇中室温脱水，各级3h，无水乙醇中脱水2次，每次2h。二甲苯透明30min，60℃浸蜡3h，包埋，低温保存待切。

1.2.2 切片染色：用LEICA RM 2245轮转式切片机切片，厚约5μm，40～45℃水浴展片，45℃烤片3h，快速脱蜡至水，苏木精染液染色5min，1%盐酸酒精分化10s，1%氨水蓝化3min，1%醇溶性伊红染液染色3min，快速梯度乙醇脱水各5min，二甲苯透明10min，中性树胶封片，显微镜下进行观察。

2 结 果

A组眼球大体结构及晶状体保存尚可，视网膜各层结构均能显示，但存在视网膜部分脱离、碎裂情况，视网膜各层排列疏松，有裂隙存在(图1，2)；B组眼球结构破损，视网膜出现大面积的脱离及卷折，大量碎裂，不能清晰显示各层细胞结构，且视网膜结构被压缩，染色深，细胞间界限不清，晶状体破碎，但角膜各层结构完整清晰(图3，4)；C组眼球各层结构保持完整，无碎裂，晶状体完整，可显示晶状体上皮，视网膜各层无脱离、卷折，且各层细胞排列整齐，无压缩，染色鲜艳，层次分明，细胞界限清晰，角膜、虹膜、睫状肌、巩膜静脉窦等组织结构均较清晰(图5，6)。

3 讨 论

视网膜位于眼球壁的最内层，其结构复杂，由10层结构组成。在常规石蜡切片的制作中，由于眼球各部位的结构和密度不同，质地软硬度相差悬殊，对固定液及不同浓度乙醇处理发生的反应不同，极易造成眼球变形，各层之间结构分离、移位及视网膜脱落[5]。因此，选择适当的固定液及脱水剂的浓度、控制好脱水时间是制作出结构完整的眼球石蜡切片的关键[6]。眼球标本必须将整个眼球固定后才能进行剖切，故需要固定液有很强的渗透力，能够快速穿透眼球将各层组织固定。固定液1中含有冰醋酸和高浓度乙醇，冰醋酸的组织渗透性强[7]，但会使组织迅速膨胀，因此要求固定时间要相应缩短，乙醇对组织有收缩作用[8]，可以部分抵消冰醋酸对组织的膨胀作用。但本实验中A组结果显示存在视网膜部分脱离、碎裂的情况，可能是由于高浓度乙醇的收缩作用太强，过多地抵消了冰醋酸对组织的膨胀作用。固定液2为4%多聚甲醛，其固定眼球时由于渗透压较大，对组织收缩作用强，造成眼球内外压力不同，使眼球变形，视网膜脱落、卷折，形成固定液性的视网膜脱落[9]，但其对角膜结构的固定较为理想，具体机制还有待于进一步实验证明。固定液3中加入了丙酮，使固定液更为温和，组织收缩幅度小，并且渗透力迅速而均匀，组织不易出现变脆现象。实验证明，固定液3固定的组织制作的石蜡切片的质量明显优于固定液1、2。同时，本实验中采用于固定4～5h后由角巩膜缘向眼球内注射固定液的方法，一方面可以使固定液更好地向球内各层组织渗透，另一方面可以使眼球内保持一定的压力，维持眼球的形状，防止视网膜脱离。脱水时应从较低体积分数的乙醇开始[10]，且浓度差越小越好，逐级脱水至无水乙醇，这样可以减少由于乙醇浓度骤升后引起的细胞收缩，避免引起视网膜脱离。同时，浸蜡时应选用熔点较低的软蜡，以减轻因浸蜡温度过高、时间过长引起的组织收缩。

本实验表明固定液3的固定效果优于其他2种固定液，并且操作方法较为简单，所用试剂均为实验室常备试剂，无毒无害，所制作的切片结构完整，便于观察，是固定大鼠眼球组织，制作病理切片的较好方法。(本文图见封二)

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