视神经脊髓炎患者血清水通道蛋白4抗体水平与临床特征的相关性

王静 杨丽 杨春生 李婷 张大启 齐媛 高春丽

视神经脊髓炎(neuromyelitits optica，NMO)，又称Devic病，是视神经和脊髓同时或相继受累的急性或亚急性脱髓鞘病变，与多发性硬化同属中枢神经系统脱髓鞘疾病。2004 年，Lennon等[1]通过间接荧光免疫法检测到NMO患者血清中有一种特异性自身抗体NMO-IgG,其敏感性为73%,特异性为91%,而在多发性硬化患者血清中该抗体检测阴性。2005年Lennon等[2]发现水通道蛋白4(aquaporin-4，AQP-4)为NMO-IgG的靶抗原，进一步证明了NMO是一种自身免疫性水通道病。2006年，Wingerchuk等[3]在修订NMO诊断标准中将血清AQP-4抗体阳性列为NMO支持诊断依据。目前NMO临床诊断及研究中多用AQP-4抗体的定性检测，而其定量检测研究较少。本文利用荧光免疫沉淀法(fluorescence immunoprecipita-tion assay, FIPA)检测了78例NMO患者AQP-4抗体水平，旨在探讨其抗体水平与临床特征的相关性。

1 对象和方法

1.1研究对象均为来自于2010-11-2013-05天津医科大学总医院神经免疫中心就诊及随访的78例NMO患者。所有入组NMO患者符合2006年Wingerchuk等修订的NMO疾病诊断标准[3]。75例患者行脊髓MRI检查，64例患者行头MRI 扫描，所有患者均行免疫荧光整细胞染色法[4](cell-based assay，CBA)检测血清AQP-4抗体。10名健康对照来自于体检中心健康志愿者。清晨空腹采集静脉血，离心后血清冻存于-80°C冰箱备用。对于患者均于急性期未接受大剂量免疫抑制剂治疗时采集血标本,采血同时进行EDSS评分。

1.2方法回顾性分析NMO患者的临床、影像学及实验室资料，应用FIPA检测血清AQP-4抗体并分析AQP-4抗体水平与临床特征的相关性。

1.2.1试验材料：增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescence protein,EGFP)标记的人AQP-4(EGFP-AQP-4) M23质粒由牛津大学临床神经科惠赠，DMEM培养基购自Solarbia公司，聚乙烯亚胺(polyethyleneimine,PEI)、去蛋白酶抑制剂(protease inhibitor cocktail,PIC)、琼脂糖凝胶4B蛋白A(protein A-sepharose 4B)均购自Sigma公司，小牛血清、超低IgG胎牛血清均购自GIBCO公司。SYNGERY 2酶标仪购自美国Bio-teck公司，倒置显微镜为日本奥林巴斯公司产品。

1.2.2AQP-4抗体检测[5-7]：(1)175 cm2培养瓶培养人胚肾293(human embryonic kidney293，HEK293)细胞；待细胞贴壁且汇合度达50%，PEI介导将EGFP-AQP-4 M23 cDNA质粒转染HEK293细胞。待转染效率至70%以上后加入细胞裂解液(10 mmol/L Tris-HCl,pH 7.5, 100 mmol/L NaCl,1 mmol/L EDTA,1% Triton X-100,使用前混入1∶100 PIC)裂解细胞，离心获取含EGFP-AQP-4蛋白的上清液。测定荧光值(fluorescent unit,FU)，并将FU值调整到500～600/200 μL上清液。(2)解冻待测血清，离心后取待测血清20 μL，加入EGFP-AQP-4 200 μL，4 ℃轮转过夜后向混合液中加入Protein A-Sepharose 4B 75 μL(经超低IgG胎牛血清封闭预处理)，室温轮转2 h；以3000 r/min离心1 min，去上清。用1 mL细胞裂解液漂洗沉淀，重复3次，加入150 μL 裂解液重悬沉淀的复合物，加入96孔酶标板中，酶标仪上获取FU值。所用激发波长488 nm，发射波长507 nm。以健康对照平均FU+3s为标准值，大于标准值定为阳性。每份血清重复检测3遍，取3次均值。

1.3统计学处理采用SPSS15.0统计软件进行分析，计数资料采用率表示，符合正态分布的计量资料采用均数±标准差表示，非正态分布的计量资料以中位数(四分位数间距)表示。采用Spearman相关性分析AQP-4抗体水平与临床特征的相关性。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1临床特征分析78例NMO患者中，男性12例(15.4%)，女性66例(84.6%)；病程为4个月～34年，中位数为5年，四分位数间距为69.25个月；起病年龄为15～80岁，中位数为42岁，四分位数间距为23.25岁；复发次数为0～10次，中位数为2次，四分位数间距为2次；其中，以视神经炎起病者31例(39.7%)，以脊髓炎起病者40例(51.3%)，两者同时发生者4例(5.1%)，以其他症状起病者3例(3.9%)。血标本采集于首次发病期的28例，复发期的50例；复发前最后一次随访EDSS评分为2.74±1.20；采集标本时脊髓受累节段数为1～16，中位数为5，四分位数间距为4；脑部脱髓鞘病灶数为0～23个，中位数为1.5个，四分位数间距为5.25个； AQP-4抗体的检测结果标准值(FU)为8,检出AQP-4抗体阳性率为73.1%(图1)。

图178例NMO患者及10例健康对照者血清AQP-4抗体FU值分布

2.2AQP-4抗体水平与临床指标的相关性分析采集标本时的EDSS评分、脊髓受累节段数、头MRI病灶数均与血清AQP-4抗体FU值呈非线性正相关，采集标本后的下一次复发间隔时间与血清AQP-4抗体FU值无相关性(图2)。

图2AQP-4抗体FU值与临床指标的相关性散点图

3 讨论

本研究采用FIPA方法检测78例NMO患者血清AQP-4抗体水平，发现血清AQP-4抗体水平与EDSS评分、脊髓受累节段数、颅内病灶数有一定的相关性。 近年来研究提示AQP-4抗体致病的可能机制为：NMO-IgG与AQP-4胞外区接合造成AQP-4表达缺失，从而导致血-脑脊液屏障的渗透性提高；NMO-IgG的主要成分IgG1和四聚体结构的AQP-4成为有效的补体激活因子，募集粒细胞，粒细胞进入血-脑脊液屏障后，产生抗体依赖的细胞毒作用和补体依赖的细胞毒作用，导致星形胶质细胞死亡；AQP-4内化的同时造成了兴奋性毒物的累积，进而造成少突胶质细胞损伤和髓鞘完整性破坏[8-11]。研究表明，AQP-4抗体很可能为NMO的致病性抗体，故推测其抗体水平与疾病严重程度相关。但目前的研究结论不尽一致。Takahashi等[12]利用CBA法发现AQP-4抗体滴度水平越高，患者失明会越完全，MRI脊髓受累节段数越多。而Hinson等[13]采用间接免疫荧光法检测AQP-4抗体，回顾分析了12例NMO-IgG阳性NMO患者，发现残疾程度(失明或瘫痪)重、预后差的NMO患者与残疾程度轻、预后好的患者比较，其NMO-IgG水平无统计学差异。作者推测造成上述研究结果不一致的原因可能与检测方法不同有关，也不除外样本量、采血时机对研究结果的影响。

目前存在多种AQP-4抗体检测的方法：间接免疫荧光法、CBA、FIPA、放射免疫沉淀法、酶联免疫吸附法、流式细胞分析法。FIPA的原理在于：将EGFP标记的AQP-4 cDNA质粒转染HEK293细胞，细胞裂解后得到EGFP-AQP-4游离蛋白；含有AQP-4抗体的血清与EGFP-AQP-4抗原结合形成抗原抗体复合物,复合物被Protein A沉淀，荧光读板机获得荧光值。荧光值与抗体滴度直线相关[5，7]，可以精确反映抗体水平。CBA是将AQP-4 M23 cDNA质粒转染HEK293细胞，血清中的抗体与细胞表面表达的AQP-4抗原结合，并通过荧光显微镜读取荧光二抗标记的已结合的抗原抗体复合物[7]。目前认为CBA法检测AQP-4抗体的敏感性和特异性最高，但CBA法不适于批量检测，且不能定量检测。该研究在临床诊断中引用了CBA法，而利用FIPA定量检测AQP-4抗体来分析抗体与临床病情相关性。

本研究结果显示AQP-4抗体水平与NMO病情有一定相关性，提示AQP-4抗体水平与疾病严重程度相关，由于疾病病情受多种因素影响，故AQP-4抗体水平与疾病严重程度的确切关系有待于进一步研究。目前，血清AQP-4抗体水平与头MRI病灶数目相关性分析的研究较少。既往研究表明，超过5O%的NMO存在颅内病变，其特征性病变位于下丘脑、三脑室、导水管、脑桥被盖及四脑室周围等AQP-4高表达区[14-15]，且尚有NMO广泛脑部病变的报道，认为其可能与AQP-4相关的血管源性水肿有关[12，16-17]。该研究发现AQP-4抗体水平与颅内病灶数呈正相关，提示AQP-4抗体可能是形成颅内病灶的主要原因。

本研究结果显示，患者急性期血清AQP-4抗体水平与至下次复发间隔时间无明显相关，提示单次血清AQP-4抗体水平预测复发的意义可能不大。但多数研究表明，AQP-4抗体阳性的患者与阴性患者相比，更易出现疾病的复发[18],且血清NMO-IgG水平明显提高往往早于NMO复发出现[19]。所以，对NMO患者密切随访，动态监测患者血清AQP-4抗体水平，可能对疾病复发的预警和预防有重要意义。

由于本研究样本量较小，有关AQP-4抗体水平与NMO患者临床特征的确切关系还有待于进一步研究证实。

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