降解含硫杂环芳烃中度嗜盐菌的筛选及降解特性研究

李 琳，赵朝成，刘其友，张云波，王 雷

(中国石油大学(华东)化学工程学院，山东 青岛 266580)

含硫杂环芳烃(polycyclic aromatic sulfur heterocycles，PASHs)是原油中硫的主要存在形态，主要是噻吩类化合物，也包括少量带有芳基的硫醇、硫醚和二硫化物[1]，属于污染面广、毒性较大的难降解有机物，广泛存在于石油污染土壤、海底沉积物、被污染的地下水及许多工业(如焦化、石油化工、农药、染料等)废水中。环境介质中的PASHs比多环芳烃(PAH)具有更强的致癌性和生物富集性，是最不易被降解的化合物之一[2-3]。

在石油的开采加工过程中，遗漏、井喷、输油管道泄漏等问题会导致油田区土壤受到PASHs的污染，对生态环境和人体健康构成严重威胁。相比物理和化学处理方法，微生物法处理PASHs污染土壤具有经济高效、无二次污染等优点，成为近年来的研究热点[4]。

我国许多油田都位于干旱和半干旱地区，如胜利油田、华北油田和新疆油田等。由于油田区特殊的气候和水环境条件，容易造成油田区土壤的盐分积累[5]。目前很多具有PASHs降解能力的细菌和真菌相继被筛选出来，但是由于油田区土壤的高盐度使得这些微生物的降解能力受到抑制。因此，筛选具有耐盐性的PASHs降解菌可能是有效的解决途径。中度嗜盐菌是一类依赖0.5～2.5 mol·L-1盐浓度生长的微生物类群，营养要求简单，对环境有很好的适应能力，在环境污染治理方面日益受到重视[6]。

作者以二苯并噻吩作为PASHs的模式化合物，从胜利油田石油污染的高盐土壤中筛选分离出6株具有PASHs降解能力的中度嗜盐菌，并考察了底物初始浓度、pH值、温度及氮磷比对降解效果的影响，通过正交实验得到其最佳培养条件，以期为深入研究中度嗜盐菌对PASHs的降解奠定基础。

1 实验

1.1 土样采集及预处理

以胜利油田石油污染土壤作为土样。取4种不同深度(0～5 cm、5～10 cm、10～15 cm、15～20 cm)的土样混合均匀，装入采集袋中。土样过2 mm筛，去除2 mm以上的沙砾和植物残体，采用四分法收集土样，于4 ℃保存备用。

1.2 培养基

无机盐培养基(g·L-1)：Na2HPO40.6，KH2PO40.2，NaNO34.0，MgSO40.3，CaCl20.01，FeSO40.01，NaCl 50，酵母膏 0.5，pH值7.5。

LB培养基(g·L-1)：蛋白胨10.0，酵母浸出汁5.0，NaCl 50.0，琼脂20.0(固体培养基用)。

筛选固体培养基：在固体培养基上涂一定浓度的二苯并噻吩。

富集培养基：在无机盐培养基中加入一定浓度的二苯并噻吩。

1.3 方法

1.3.1 中度嗜盐菌的筛选、分离与保藏

取5 g土样加入到含二苯并噻吩50 mg·L-1、盐度为5%的无机盐培养基(100 mL)中，于30 ℃、160 r·min-1条件下振荡培养7 d。再按15%的接种量转接至新的无机盐培养基中，如此重复5次进行驯化培养。最后将菌群富集培养液依次稀释成浓度梯度为10-3、10-4、10-5、10-6、10-7的菌悬液，然后取0.1 mL菌悬液涂布在筛选固体培养基上，倒置，于30 ℃培养12～16 h。挑选菌落周围出现清晰降解圈的菌株，转接斜面，于4 ℃冰箱保藏。观察菌株形态，并进行生理生化实验。

1.3.2 降解率的测定

将培养后的培养基用盐酸酸化至pH≤2，用乙酸乙酯等体积萃取，于3 000 r·min-1离心10 min后取上清液用气相色谱仪(Bruker 450 GC-FID)测定二苯并噻吩含量，按下式计算降解率(η)：

式中：c0、ck分别为降解前后二苯并噻吩的浓度;η0为空白降解率。

色谱条件：以恒流方式进样，进样量1 μL；升温程序：柱温50 ℃保持4 min，然后以3 ℃·min-1升温至130 ℃，再以15 ℃·min-1升温至300 ℃，最后在300 ℃下保持15 min；进样器和检测器的温度均为300 ℃，载气为氦气，流速1 mL·min-1。

1.3.3 最佳培养条件的研究

针对筛选得到的降解效果最好的中度嗜盐菌，通过单因素实验考察底物初始浓度、pH值、温度、氮磷比等因素对其降解效果的影响，并在此基础上设计pH值、温度及氮磷比的3因素3水平正交实验，确定其最佳培养条件。

2 结果与讨论

2.1 降解二苯并噻吩中度嗜盐菌的筛选及生理生化特征

将经过5次富集驯化后的混合培养物在筛选固体培养基上稀释涂布，挑选有明显降解圈、不同颜色和形态的单菌落，经过复筛、纯化后得到6株能够以二苯并噻吩为唯一碳源和能源生长的中度嗜盐菌，其中菌株SL-4对二苯并噻吩的降解率最高(37.2%)，如图1所示。

图1 筛选菌株的降解率Fig.1 The degradation rate of the strains screened

对筛选得到的6株具有降解能力的中度嗜盐菌进行形态观察和生理生化实验，结果如表1所示。

表1筛选菌株的形态特征及生理生化特征

Tab.1 The morphological,physiological and biochemical characteristics of the strains screened

注：“+”表示阳性，“-”表示阴性。

2.2 底物初始浓度对SL-4菌株降解效果的影响(图2)

图2 底物初始浓度对SL-4菌株降解二苯并噻吩的影响Fig.2 The effect of initial substrate concentration on degradation of dibenzothiophene by strain SL-4

由图2可知,SL-4菌株在以二苯并噻吩为唯一碳源的含盐(NaCl 5%)培养基中可以降解不同浓度的二苯并噻吩，其降解率随底物初始浓度的增大先升高后降低，当底物初始浓度为100 mg·L-1时，降解效果最好，降解率达到56.4%。原因可能是低浓度的底物满足不了微生物的生长需要，不利于维持降解所必需的微生物量，而高浓度的底物又对微生物有一定的毒害作用，不利于微生物的生长代谢，同时降解产生的代谢产物也会抑制底物的降解[7]。

2.3 pH值对SL-4菌株降解效果的影响

培养基盐度为5%，pH值对SL-4菌株降解二苯并噻吩效果的影响如图3所示。

图3 pH值对SL-4菌株降解二苯并噻吩的影响Fig.3 The effect of pH value on degradation of dibenzothiophene by strain SL-4

由图3可知，SL-4菌株在pH值为5.5～9.5范围内均能降解二苯并噻吩，但pH值对降解效果影响较大，SL-4菌株的最适pH值为7.5。原因可能是pH值会改变微生物细胞的表面电荷，从而影响微生物对营养物质的吸收[8-9]。相对于酸性环境，偏碱性(7.5～8.5)的环境更适于SL-4菌株的生长。

2.4 温度对SL-4菌株降解效果的影响

微生物的生长代谢是在酶的催化作用下进行的，适宜的温度是保证酶活性的重要条件之一[10]。温度对SL-4菌株降解二苯并噻吩效果的影响如图4所示。

图4 温度对SL-4菌株降解二苯并噻吩的影响Fig.4 The effect of temperature on degradation ofdibenzothiophene by strain SL-4

由图4可知，SL-4菌株在25～45 ℃范围内均能降解二苯并噻吩。随着温度的升高，SL-4菌株对二苯并噻吩的降解率先升高后降低，在温度为30 ℃时，降解率最高。原因可能是温度过高时SL-4菌株的活性降低，降解效果变差。

2.5 氮磷比对SL-4菌株降解效果的影响

微生物的生长受到氮磷营养盐浓度的影响，而氮、磷的影响往往是相互的，所以在实际生物修复污染物的过程中，应当投加适宜比例的氮磷物质来提高降解微生物的修复效果。氮磷比对SL-4菌株降解二苯并噻吩效果的影响如图5所示。

图5 氮磷比对SL-4菌株降解二苯并噻吩的影响Fig.5 The effect of N∶P on degradation ofdibenzothiophene by strain SL-4

由图5可知，当氮磷比为5∶1时，SL-4菌株对二苯并噻吩的降解效果最好，降解率达到63.2%。

2.6 正交实验结果与分析

基于单因素实验结果，以pH值、温度及氮磷比为考察因素，以二苯并噻吩的降解率为考核指标进行3因素3水平正交实验，实验结果及分析如表2所示。

表2正交实验结果及分析

Tab.2Theresultsandanalysisoforthogonalexperiment

实验号pH值温度/℃氮磷比降解率/%16.5254∶153.226.5306∶159.436.5358∶150.147.5256∶167.157.5308∶163.367.5354∶151.278.5258∶154.688.5304∶150.298.5356∶153.1k154.23358.30056.533k260.53357.63359.867k352.63351.46756.000R7.9006.8338.334

由表2可知，各因素对SL-4菌株降解效果的影响大小依次为：氮磷比>pH值>温度；该中度嗜盐菌株的最佳培养条件为：pH值7.5，温度25 ℃，氮磷比6∶1。

3 结论

从胜利油田石油污染土壤中筛选得到6株对二苯并噻吩具有降解能力的中度嗜盐菌，其中SL-4菌株降解效果最好，在底物浓度为50 mg·L-1、培养基盐度为5%条件下对二苯并噻吩的降解率达到37.2%。通过单因素实验考察了底物初始浓度、pH值、温度及氮磷比对SL-4菌株降解效果的影响，正交实验结果表明氮磷比对SL-4菌株降解效果的影响最为显著，最佳培养条件为：pH值7.5、温度25 ℃、氮磷比6∶1。

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