miRNA在急性心肌梗死诊断中的研究进展

裴颖皓(综述)，宫剑滨(审校)

(南京大学医学院临床学院/南京军区南京总医院心脏内科，南京 210002)

微RNA(micorRNA，miRNA)是近年来发现的一组内源性高度保守的非编码单链RNA，其在细胞核内生成，由20～22个核糖核苷酸组成，调控上游基因表达和下游蛋白翻译过程。1993年，Lee等[1]在线虫的胚胎中发现了第一个miR-lin-4。由于miRNA能调节多个基因的表达，能够识别特定的目标信使RNA(mRNA)，使其在表达水平上发生变化，进而调控相应基因的上调或下调。目前miRNA已成为医学研究的热点，近年的研究表明miRNA可能与急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)的发生密切相关。

1 miRNA概述

1.1miRNA的生成与作用机制 编码miRNA的基因通过RNA聚合酶Ⅱ转录为长度约数千个碱基的初级miRNA(pri-miRNA)。pri-miRNA具有帽子结构和多聚核苷酸尾巴，在双链RNA特异核酸酶Drosha及其辅助因子的作用下被剪切成60～100个核苷酸组成的茎-环结构前体(pre-miRNA)。pre-miRNA再被核穿膜蛋白蛋白5识别并从细胞核转运到细胞质中，在双链RNA特异性核糖核酸酶Dicer作用下进行第二次裂解，生成一种长度约22个核苷酸的双链miRNA复合体，随后在RNA解螺旋酶作用下，一条为成熟的miRNA并结合到RNA诱导的沉默复合物上，RNA诱导的沉默复合物依据其miRNA与靶基因序列的互补性高低发挥作用，若是完全或几乎完全配对，则导致mRNA降解；若不完全配对，则影响mRNA的成熟、转运、稳定、调控和翻译等，从而反向调控靶基因的表达[2]。而另一条链通常称为未成熟miRNA(minor miRNA)，以往被认为解螺旋后将会被酶解，但是最新的研究发现一部分minor miRNA并没有被酶解，而是调控体内miRNA的稳态，进而影响着下游的转录和翻译[3]。

miRNA在循环中较稳定，可能与外分泌体或微粒的包裹有关，核糖核酸酶、多次冻融循环和强酸强碱等均不容易破坏它们。但若把异种miRNA注入人体内，则会被迅速降解[4]。

1.2miRNA的命名 一个系统的命名包含三部分内容，即物种、miRNA类别、序号，三者间用短线连接(表1)[5]。

表1 miRNA的命名

1.3miRNA的调控 生理状态下血清中miRNA水平如何调控，病理情况下miRNA变化的调控机制至今仍有争论。有学者认为以下几点值得关注[6]：①细胞膜受损后miRNA由细胞内游离出细胞外；②应激条件下肝细胞释放；③细胞内miRNA的合成与降解平衡；④循环中miRNA的降解；⑤细胞吸收胞外的miRNA。

上述5点相互促进、相互制约共同决定血清miRNA水平变化。D′Alessandra等[6]发现一只大鼠结扎冠状动脉后血清miR-1、miR-133a/b和miR-499-5p表达升高，而在梗死区或缺血区上述miRNA表达下降，提示AMI后miRNA的升高主要是细胞受损后释放出来的。但矛盾的是至今没有发现其他心肌特异miRNA，如miR-24、miR-26a、miR-126和miR-30c在AMI后水平升高[7]。因此，血清中miRNA水平的具体调控机制仍需进一步的研究。

2 miRNA与AMI

生理情况下，血清中存在丰富的miRNA，当细胞受损时，胞质中的miRNA游离到细胞外，是潜在的诊断标志物。早年的一些动物实验结果已经证明,miRNA在转录或转录后修饰水平调节着心肌生长发育、纤维化和重构等。通过对心肌梗死动物血清的动态监测，发现一些miRNA在AMI后动态变化。其中影响着心肌生长、发育和纤维化的miRNA在心肌梗死后的早期会大量表达。因此，心肌梗死后患者血清中miRNA的动态变化意义重大[8]。

2.1miRNA与AMI的诊断 目前对于AMI诊断与miRNA研究很多，主要包括miR-1、miR-133a/b、miR-499-5p、miR-208a/b等，但各项研究结果矛盾较多。

Zile等[8]认为，AMI后血清miRNA的水平变化与AMI后的心肌重构相关,他们对比了AMI患者心肌梗死后第2日和3个月的左心室舒张末期容积和血清miRNA水平。结果发现，AMI后左心室舒张末期容积逐渐增加；miR-21在AMI后第2日表达下降，但在第5日表达上升并超过基线，到后期逐渐恢复基线水平；miR-29a在心肌梗死后第5日升高，后期逐渐回到基线水平；miR-208在心肌梗死后第5日增加，直到3个月它的水平依然高于基线。

Ai等[9]发现，miR-1是AMI潜在的诊断标志物，他们通过检测159例冠状动脉粥样硬化性心脏病患者的血清miR-1水平，发现AMI患者血清miR-1水平显著升高，出院后其水平逐渐恢复到基线，并且miR-1的表达量与年龄、性别、血压、糖尿病以及心肌酶谱等无关；ROC曲线分析计算曲线下面积为0.774。

同样，Chen等[10]通过细胞实验、动物模型和临床试验发现miR-1是一个高敏的AMI标志物，细胞模型中观察到培养液中的miR-1升高且持续24 h左右；大鼠AMI模型中检测到血清miR-1在AMI后6 h内迅速升至峰值(约为基线的200倍)，3 d后回到基线水平；大鼠缺血预适应模型中发现，缺血预适应明显减少了血清miR-1水平和再灌注心肌损伤。临床试验发现[9]，AMI患者血清miR-1显著升高，且与肌酸激酶MB亚型呈正相关。

D′Alessandra等[6]发现AMI后血清miR-1、miR-133a/b和miR-499-5p的水平上调，miR-122、miR-375水平下调，分析AMI患者经皮冠状动脉介入术或溶栓治疗前后血清miRNA和肌钙蛋白I(cardiac Troponin I，cTnI)的动态变化后发现miR-1、miR-133/b和cTnI的时间窗相似。大鼠AMI模型的结果与上述临床结果基本一致。但是,在Ai等[9]的研究中，并没有发现心肌梗死后miR-133水平的变化，因此miR-133对于诊断心肌梗死的意义仍需进一步证实。

Ji等[11]首先在359个候选miRNA中筛出心肌特异性miR-208和miR-490，后者少量表达于大小肠、肺、肾上腺和胃组织，所以选用miR-208作为AMI标志物在异丙肾上腺素诱导的大鼠AMI模型中与cTnI进行比较。结果发现，异丙肾上腺素注射3 h后，cTnI和miR-208都显著上升，miR-208在12 h后开始回落，cTnI在24 h后依然高于基线水平，在时间窗上两者差异无统计学意义。但是,上述实验存在一些问题，如β受体激动剂异丙肾上腺素引起的心肌损伤与冠状动脉阻塞引起的AMI不能等同，所以上述实验结果并不能完全令人信服。

Wang等[12]利用大鼠AMI模型，综合比较了心肌特异性miR-1、miR-133a、miR-499、miR-208a在AMI后的血清表达差异，并最终发现miR-208a灵敏度高且特异性强。与Ji等[11]研究不同的是，Wang等[12]通过结扎大鼠左前降支冠状动脉构建AMI模型并分析不同时间点(结扎后0、1、3、6、12、24 h)miRNA的动态变化，结果miR-208a在结扎后30 min开始升高，3 h达到峰值，6～12 h开始回落，24 h后检测不到。临床试验结果发现,miR-1、miR-133a和miR-499在非冠心病组中极少量存在，但miR-208a未能检测到；四种miRNA在AMI组显著升高，其中AMI症状出现起始时有90.9%的患者miR-208a升高，而4 h内所有患者的miR-208a均升高；ROC曲线分析曲线下面积分别是0.965,0.822,0.847,0.867和0.987；最佳阶段值分析miR-208a的特异度(100%)显著优于miR-1(33.3%)、miR-133a(15.2%)、miR-499(36.4%)[9]。但D′Alessandra等[6]持否定意见，因为上述试验中实时定量荧光聚合酶链反应结果显示CT峰值平均只有34.5，说明起始循环拷贝数较低，试验误差较大。AMI患者样本量只有33例，偏差较大。同时，他们曾试图在9例AMI患者中验证，只有3例血清中有少量的miR-208a升高，其他均检测不到。

上述研究结果存在不少矛盾，其原因有可能与药物的影响有关。Zhu等[13]研究发现，普萘洛尔可以明显减少大鼠AMI面积，比较普萘洛尔干预前后miRNA表达谱后发现两组的相似度只有0.39，而这种差异是普洛萘尔导致的。

上述研究均证明血清miRNA在诊断AMI方面有着特有的优势，但是具体到各个miRNA时，却存在一定的争议。总的来说，各个实验研究都存在样本量少、实验数据不完善、比较不全面、药物干扰等不足。上述研究存在的共同缺陷是期望单一miRNA进行疾病诊断和风险评估。近年来国内外不少学者提出利用多种血清miRNA组成的指纹谱联合诊断疾病，大大提高了诊断预测的敏感性和特异性，在肺癌[14]、卵巢癌[15]、结直肠癌[16]、糖尿病[17]等疾病的研究中均有报道。

2.2肌钙蛋白与miRNA 肌钙蛋白是临床上常用的心肌损伤标志物，通常在心肌损伤后4～8 h内开始升高[18]。而动物实验已证实，miRNA在冠状动脉结扎后1 h即可升高，敏感性显著高于肌钙蛋白[19]。在心肌细胞内，肌钙蛋白主要是结合在肌原纤维上，只有2.8%～4.1%的cTnI存在于细胞质中，而miRNA与蛋白质结合形成的复合物绝大部分存在于细胞质中[18]。这种差异可能导致细胞损伤时肌钙蛋白和miRNA释放速度不同。肌钙蛋白主要由肾脏排泄，终末期肾病患者偶见升高，因此肾功能在一定程度上影响肌钙蛋白检测的灵敏度。在双肾切除大鼠模型的血清中并没有发现miRNA升高，说明miRNA的代谢不受肾功能影响。检测效率方面，miRNA主要通过PCR仪分析，比肌钙蛋白的检测更加快捷方便。因此，miRNA比肌钙蛋白更具有临床实用价值。

2.3miRNA对AMI后并发症的影响 当患者发生AMI后，循环中的心脏特异性miRNA表达量会发生明显变化，这次变化的miRNA同时也参与到AMI后并发症的发生机制中，如miR-499-5p的水平上调与细胞衰老密切相关，可能在细胞分化终末期发挥重要作用。也有实验证明，miR-499可以促进心肌祖细胞向心肌细胞的分化[20]。

虽然miR-1和miR-133由不同的基因位点转录，但是两者仅有一个碱基差异，因此它们的生物学作用十分相似。它们可以通过抑制部分生长基因，进而控制心肌肥厚的发展[21]。它们都对起搏电流If有影响，所以参与了心律失常的调控[22]。在诱导细胞方面，miR-1主要起促凋亡作用，而miR-133则相反。

Fleissner等[23]发现miR-24可以通过靶向作用转录因子GATA2和依赖p21激活PAK4(p21活化激酶4)激酶，诱导内皮细胞凋亡。在斑马鱼胚胎中发现，提高miR-24表达后可能因为细胞凋亡增加而损害血管生成发育。因此，miR-24可能影响AMI面积以及AMI后心肌重构和心功能的恢复。

3 小 结

国内外研究已经证明，miRNA可以通过外分泌体和微粒的形式释放出细胞，并被其他细胞所再吸收，调节其生物学活性[10]。但是,AMI时血清中水平发生改变的miRNA是否以外分泌体或微粒的形式存在？它们是否进入其他的细胞？是否影响了其他细胞的生物学活性？这些仍未研究明确，将是未来研究的热点。

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