喹啉酮荧光探针的合成及性能研究*

王会镇,肖梅杰,张军庆,肖学建,杨海君

(西南科技大学材料科学与工程学院//四川省非金属复合与功能材料重点实验室培育基地，四川 绵阳 621010)

稀土金属配合物具有独特的发光性质，在发光材料、结构探针、荧光分析和生物传感器等领域有着广阔的应用前景。1979 年，Soini等[1]提出利用稀土荧光螯合物替代放射性同位素作为免疫分析探针，由此开创了稀土螯合物作为荧光探针的应用领域。若直接用稀土离子来标记抗原或抗体的话，标记率很低，往往需要加入螯合剂，以形成稀土金属离子的螯合物。稀土离子的荧光，不仅与自身的能级结构有关，而且与配体的性质有关。配体不同，稀土离子的激发光和发射光也会有所不同[2]。通过设计不同结构的螯合剂，即可得到特定性能的稀土荧光探针。杨燕生等设计合成了一系列稀土金属螯合物，并对其结构和性能进行了研究，提出了稀土鳌合物荧光探针必备的结构条件[3]。由于烯土荧光探针的特殊性质，稀土螯合物作“特效试剂”在生物学、医药学等研究中的应用越来越广泛，合成得到结构简单而且性能优异的稀土螯合物已成为一个研究热点[4-5]。

DNA作为生命遗传的重要物质，自身的荧光效率很低，一般情况下几乎检测不到DNA的荧光，因此常选用荧光分子作为探针来实现对DNA分子的特异性识别和定量分析，这对基因学、分析生物学、病毒学等相关学科的发展具有非常重要的意义[6-7]。目前用于DNA研究的方法有很多种，如荧光光谱法、紫外光谱法和电化学方法等。具有检测快速、操作简单、重复性好及辐射小等优点的荧光探针法具有传统方法无法比拟的优点。已报道的DNA探针中利用荧光淬灭现象的占多数，但荧光猝灭的DNA探针在荧光成像等可视化应用中价值不高[8-9]。合成得到更加灵敏且生物相容性好的荧光探针已经成为当前研究的热点。喹啉酮类化合物具有良好的生物相容性，以及较好的荧光性能，因而可将其作为生物相容性荧光探针用于生物检测。本文拟合成结构简单的喹啉酮氨三乙酸衍生物，并研究其与DNA相互作用及其稀土金属镧螯合的荧光行为。

1 实验部分

1.1 试剂

间苯二胺(AR，天津市光复精细化工研究所)；乙酰乙酸乙酯、乙酸酐、吡啶、氨水、无水乙醚、盐酸、乙醇、硝酸镧、DMSO(AR，成都市科龙化工试剂厂)；氨三乙酸(AR，西陇化工股份有限公司)；鲱鱼精DNA(AR，Sigma 公司)；三羟甲基氨基甲烷(AR，天津科密欧化学试剂开发中心)；Tris (0.05 mol/L)-HCl 缓冲溶液临时配制，水为二次蒸馏水。

1.2 仪器

紫外、可见—近红外分光光度计UV-3400(岛津公司)，荧光分光光度计LS-55(美国珀金埃尔默公司)，液相色谱-质谱联用仪Varian1200(美国瓦里安公司)，傅里叶变换红外光谱仪Spectrum One型(美国PE仪器公司)，元素分析仪Vario EL CUBE(德国元素分析系统)，600 MHz核磁共振谱仪Bruker Aance600(瑞士布鲁克公司)，数字式电导率仪DDS-11A(上海日岛科学仪器有限公司)，同步热分析仪SDT Q600(美国TA仪器公司)。

1.3 试验过程

1.3.1 4-甲基-7-氨基-2-喹啉酮(3)的合成[10]将间苯二胺(1.00 g, 9.26 mmol)加入到乙酰乙酸乙酯(1.45 g , 11.2 mmol )中，加热回流反应20 h。自然冷却至室温，加入冰水(10 mL)，剧烈搅拌，过滤析出的沉淀，并用水洗3次。将所得到的固体用甲醇重结晶3次，得白色晶体，θmp为276～279 ℃，产率75%。4-甲基-7-氨基-2-喹啉酮(3)的合成反应式如下：

1.3.2 化合物5的合成[11]将129 mg氨三乙酸溶于1.75 mL吡啶中，50 ℃下加热10 min。然后加入0.065 mL醋酸酐，之后在100 ℃下反应30 min，待混合物温度下降到50 ℃时加入226 mg 4-甲基-7-氨基-2-喹啉酮，将混合物加热到100 ℃反应1 h。冷却后减压蒸馏除去吡啶，然后加入适量氨水将pH值调为9.5，用无水乙醚萃取3次。在水相中加入稀盐酸，调节pH为3左右，过滤析出的白色固体，用乙醇/水(体积比为50∶50 )重结晶3次，得白色固体，熔点为182～185 ℃，产率20%。化合物5的反应式如下：

1.3.3 镧配合物6的制备 将硝酸镧(0.433 g，1 mmol)溶于少量的水中备用。将化合物5(0.414 g，1.12 mmol)加到20 mL水中，加入两滴氨水促进溶解。然后将硝酸镧的水溶液倒入化合物5的水溶液中，立即有白色沉淀生成。加热回流1 h，旋蒸除去一部分水之后，自然降温至室温，然后在8 500 r/min下离心5 min。倾出上清液，白色固体用蒸馏水洗两次，烘干即得到配合物6。

1.3.4 化合物6的热分析 样品用量3.457 0 mg，升温速率20 K/min，空气气氛，空气流速100 mL/min，实验温度范围为室温至1 400 ℃。

1.3.5 化合物5与鲱鱼精DNA作用[12]以pH = 7.4的Tris-HCl缓冲液为溶剂，分别配制化合物5的溶液(1.0×10-6mol/L)和DNA的溶液(1.0×10-4mol/L)。在1 cm比色皿中，加入3.00 mL化合物5的溶液，以此溶液为空白参比测定其荧光光谱(温度为25 ℃，激发波长为320 nm，激发和发射光谱扫描狭缝宽度均为5.00 nm，激发电压为700 V)。然后在该溶液中分次加入一定量的DNA 溶液(每次加入体积为20 μL)，每次加入DNA溶液后均需充分搅拌，使溶液混合均匀后进行荧光扫描。

2 结果与讨论

2.1 4-甲基-7-氨基-2-喹啉酮(3)的合成及表征

图1 4-甲基-7-氨基-2-喹诺酮(3)的红外图谱Fig.1 FTIR spectrum of 7-amino-4-methyl-2-quinoline (3)

2.2 化合物5的合成及表征

通过氨三乙酸酐与化合物3反应来制备化合物5。在醋酐的作用下先将氨三乙酸转化为对应的酸酐，可以大大增加氨三乙酸与化合物3中氨基的反应性。为了简化该反应，直接在合成氨三乙酸酐的溶液体系中加入化合物3进行反应，不需要对氨三乙酸酐进行分离纯化。由于醋酐与氨基反应的活性很高，这样就需要严格控制醋酐的量，保证氨三乙酸转化为酸酐后体系中醋酐剩余量很少。本实验中加入1 mol的醋酐，与氨三乙酸反应完成后体系中的醋酐剩余量很有限，因而可以成功得到目标产物5。

图2 化合物5的IR谱图Fig.2 FTIR Spectrum of compound 5

图3 化合物5的ESI-MS谱图Fig.3 ESI-MS spectrum of compound 5

采用负离子模式对化合物5进行电喷雾质谱检测，所得质谱图见图3。计算目标产物的相对分子质量为347，图谱中的345.9为化合物5的准分子离子峰[M-1]。元素分析测定化合物5的C、H、N的质量分数分别为55.30%、4.96%和12.15%，与计算值55.33%、4.93%、12.10%相当吻合。

化合物5的1H NMR (DMSO, 600 MHz)核磁如图4所示。δ12.63 (br s, 2H)为羧基的OH氢，11.55 (s, 1H)为喹啉酮母体的1-NH，10.49 (s, 1H)为喹啉酮的7-NH。7.90 (d, 1H)、7.65 (d, 1H)和7.25 (dd, 1H)为喹啉酮的芳环氢，6.26 (s, 1H)为喹啉酮的3-H。3.58 (s, 4H)和3.53 (s, 2H)为氨三乙酸片段的3个亚甲基氢。2.39 (s, 3H)为喹啉酮的4-Me氢。

图4 化合物5的核磁氢谱Fig.4 1H NMR spectrum of compound 5

综合IR、ESI-MS、1H NMR和元素分析数据表明所合成的化合物5为4-甲基-7-氨基-2-喹啉酮的氨三乙酸酰胺衍生物。

2.3 镧配合物6的合成与表征

实验中发现，所合成的配体化合物5在水中的溶解性较差。加入少量氨水后，将其转化为对应的铵盐，可以大大增加其水溶性。在化合物5的水溶液中加入硝酸镧水溶液后，立即出现大量的白色固体，表明金属镧已经与化合物5发生了配位作用，并且所生成的金属镧配合物6的水溶性较差。

图5 配合物6的IR谱图Fig.5 FTIR spectrum of complex 6

理论上，配合物6应该是化合物5与金属La按1∶1的配合物，相对分子质量计算值为546.0。采用正离子模式对配合物6进行电喷雾质谱检测，所得质谱图见图6。图谱中的569.2为配合物6与一个钠离子结合后的准分子离子峰[M+Na]+，证明配合物6确实是化合物5与金属La 1∶1的配合物，分子式为La(C16H15N3O6)NO3。

在氧气氛围下，对配合物6进行热分析，得到配合物6的TG-DTG曲线(图7)。配合物6受热后表现为四段不连续的失重，整体失重率为72.61%。前两段失重温度在200 ℃以内，为配合物6中水分子的失去，失重率为11.49%，经计算可知配合物6分子中约含有4个水分子。第一段失重的温度在130 ℃以内，失重率约为8.63%，可判断失去的是3个结晶水，而不是配位水。第二段失重温度在130～200 ℃，失重率2.86%，判断为配合物6中失去了1个配位水分子[15]。第三段失重发生在200～380 ℃，失重率为27.65%，可能是配合物6分子中不稳定的羧基等含氧官能团的分解。第四步失重发生在380～720 ℃，可能是配体6骨架的分解和氧化等[16]。温度升高至720 ℃后，残余质量无明显变化，残留物为La2O3，残余质量百分数为27.39%，与计算值26.59%基本一致。从以上分析结果可知，配合物6的分子式为[La(C16H15N3O6)NO3]·4H2O。元素分析测定配合物6的C、H、N、O的质量分数分别为30.71%、3.86%、9.12%和33.86%，与计算值31.13%、3.59%、9.08%、33.70%，相当吻合。

图7 配合物6的TG-DTG曲线Fig.7 TG-DTG curves of complex 6

图8 配合物6的结构式Fig.8 Molecular structure of complex 6

2.4 化合物5与镧配合物6的荧光谱图分析

由图9可以看出在激发波长为320 nm下，化合物5与镧络合后荧光性能有明显的变化。化合物5的最大发射波长为374 nm，发射强度为290。当与镧形成配合物后，最大发射波长变为420 nm，发射强度为1 210，是化合物5的4.17倍，且呈现出更好的峰形。化合物5与镧配合物6的荧光波长均比激发波长，这正是Stokes荧光的特点[18]。化合物5分子中含有共轭体系，受到激发光照射时可发生电子跃迁，进而产生荧光现象(图9)。当化合物5与镧形成配合物后，配体的最低三重态能级与稀土离子激发态能级可以较好的匹配。化合物5吸收激发光能量后，会以非辐射的方式将能量传递给金属镧阳离子，从而间接地激发金属镧阳离子产生荧光[2,19]。镧配合物6的荧光性能优良，在生物检测以及光物理和光电化学等领域具有的潜在的应用价值。

图9 化合物5(1.0×10-6 mol/L)与镧配合物6(1.0×10-6 mol/L)的荧光谱图Fig.9 Fluorescence spectra of compound 5 and La-complex 6

2.5 化合物5与鲱鱼精DNA的相互作用研究

以化合物5的缓冲溶液(Tris(0.05 mol/L)-HCl)作为空白溶液，荧光扫描得到图10的曲线1。曲线2至6分别为在3 mL的空白溶液中逐次滴加20 μL的DNA缓冲溶液(1.0×10-4mol/L)后的荧光变化情况。曲线2至6中DNA的浓度分别为0.67×10-6、1.34×10-6、2.01×10-6、2.68×10-6、3.35×10-6和4.02×10-6mol/L。据此图可知，在25 ℃，pH = 7.4的环境里，随着DNA缓冲溶液的加入，体系的荧光逐渐加强，表明DNA与化合物5之间有较强的相互作用，且DNA对化合物5具有荧光增强作用。当体系中的DNA浓度达到4.02×10-6mol/L后，体系的荧光强度不再随着DNA浓度的增加而明显增强。加入DNA分子后，化合物5较大的疏水平面插入到DNA螺旋碱基对中，发生π-π堆砌作用，得到比化合物5更大的共轭结构，从而获得更高的荧光强度。此外，在DNA加入前，化合物5在水溶液中因被水分子包围，荧光较弱，当化合物5以插入作用模式进入到DNA的疏水区域时，减小了水分子对其的碰撞，化合物5分子本身的热振动减少，能量可更高效率的转化为荧光发射，使化合物5荧光强度增加，即产生增色效应[20-21]。图中显示荧光强度与DNA浓度的关系呈正相关，可将该化合物用于DNA的定量检测等。

图10 鲱鱼精DNA存在时化合物5荧光谱图Fig.10 Fluorescence spectra of compoumd 5(1.0×10-6 mol/L) in the presence of herring DNA

2.6 DNA浓度与化合物5荧光强度的关系

图11中横坐标为溶液中的DNA浓度，纵坐标为最大荧光发射强度(测试条件为25 ℃，pH 7.4)。此环境下化合物5对DNA的响应非常迅速，2 min内即可达到平衡，且在25 ℃避光条件下，相对荧光强度可保持7 h不变。由图可知，在0～4.02×10-6mol/L浓度区间内，荧光发射强度与DNA浓度呈线性相关，可用于DNA的定量检测等。以10%的荧光增强计算，化合物5对DNA浓度的检测限可低至5×10-7mol/L。

图11 DNA浓度对化合物5荧光强度的影响Fig.11 Influence of DNA concentration on the fluorescence intensity of compound 5

3 结 论

以间苯二胺和乙酰乙酸乙酯为原料，成功合成得到了新的喹啉酮类荧光化合物5以及化合物5与金属镧的配合物6。配合物6与未配位的化合物5相比，荧光波长红移至420 nm，且呈现出更好的峰形，荧光强度显著增强，是配体化合物5荧光强度的4.17倍。由于其优良的荧光性能，配合物6在生物检测及光电化学等领域有着潜在的应用价值。化合物5与DNA相互作用研究表明，化合物5与DNA有很强的相互作用，DNA对化合物5有荧光增强作用。化合物5的荧光强度与DNA的浓度在0～4.02×10-6mol/L范围内呈线性关系，可将其用于DNA的定量检测等。

参考文献：

[1] SOINI E, HEMMILA I. Floroimmunoassay: present status and problems [J]. Clinical Chemistry，1979, 25(23): 353-361.

[2] 郭周义,田振,贾雅丽.时间分辨荧光免疫分析方法的光谱研究 [J]. 光谱学与光谱分析,2004, 24(5): 596-599.

[3] 史华红,杨燕生.人尿IgG的时间分辨荧光免疫分析法以铕标记链亲合素作为标记物 [J]. 中山大学学报:自然科学版,1996, 35(2): 71-74.

[4] 陈秀英,彭孝军. DNA分子荧光探针 [J]. 化学通报，2004, 67: 2-6.

[5] 常文保,王敏灿,张柏林,等.稀土螯合物探针及其在时间分辨荧光免疫分析中的应用 [J]. 大学化学, 1997, 12(1): 1-2.

[6] YOU Y, XU W, TANNENAUM A. Behavioral analysis of anisotropic diffusions in image processing [J]. IEEE Transaction on Image Processing, 1996, 5(11): 1539-1553.

[7] PERONA P, MALIK J. Scale-space and edge detection using anisotropic diffusion [J]. IEEE Transaction on Pattern Recognition and Machine Intelligence, 1990, 12(7): 629-639.

[8] YU L Y, KAVEH M. Fourth order partial differential equations for noise removal [J]. IEEE Transaction on Image Processing, 2000, 9(10): 1723-1730.

[9] 杨斌盛, 刘文, 任列香,等.八肋游仆虫中心蛋白N-端半分子金属离子结合性质的光谱研究 [J]. 山西大学学报:自然科学版, 2009, 32(4): 572-576.

[10] KATHURIA A, PRIYA N, KARAM C. Substrate specificity of acetoxy derivatives of coumarins and quinolones towards calreticulin mediated transacetylation: investigations on antiplatelet function [J]. Bioorganic & Medicinal Chemistry, 2012, 20: 1624-1638.

[11] SERDONS K, VERDUYCKT T, CLEYNHENS J. Development of 99mTc-thioflavin-T derivatives for detection of systemic amyloidosis [J]. Journal of Labelled Compounds and Radiopharmaceutical, 2008, 51: 357-367.

[12] 费丹,王兴明.亚甲基蓝与鲱鱼精DNA 相互作用的光谱法研究 [J]. 化学学报,2008, 66(4): 443-448.

[13] FARHAN A S, NAJMA S, AGHA Z M, et al. Facile and manifest spectrophotometric methods for the determination of six quinolone antibiotics in pharmaceutical formulations using iron salts [J]. Medicial Chemisity Research, 2010, 19: 1259-1272.

[14] WANG X H, FAN L, LIU H, et al. Chitosan-metal complexes as antimicrobial agent synthesis, characterization and structure activity study [J]. Polymer Bulletin,2005, 55: 105-113.

[15] ZHAO Y R， HOU A X， DONG J X，et al.Solution-reaction calorimetric study of coordination compounds of rare earth perchlorates with alanine and imidazole [J]. Chinese Journal of Chemistry, 2004, 22: 1267-1271.

[16] 何其庄,杨小飞,钱秀萍. 稀土间氨基苯甲酸8-羟基喹啉三元配合物的合成、表征及抑菌作用研究[J]. 中国稀土学报,2002, 10(20): 1-5.

[17] GEARY W J. The use of conductivity measurements inorganic solvents for the characterisation of coordination compounds [J]. Coordination Chemistry Reviews,1971, 7(1): 8l-85.

[18] 杨一心,宋应谦,忽满利,等. 稀土铽配合物的升频转换荧光 [J]. 光子学报, 2011, 30: 971-972.

[19] BAZIN H, PRÉAUDAT M, TRINQUET E. Homogeneous time resolved fluorescence resonance energy transfer using rare earth cryptates as a tool for probing molecular interactions in biology [J]. Spectrochimica Acta: Part A, 2001, 57: 2197-2211.

[20] 杨卫民,刘利军,杨玲, 等. 水杨醛缩肼基甲酸甲酯铜配合物的合成、表征及其与DNA的相互作用分析 [J]. 分析测试学报,2008, 27: 1075-1079.

[21] HU X X, LI P H, KELVIN W K. Synthesis and characterization of fluorescent copolymer containing rare earth metal complex and its interaction with DNA [J]. Journal of Polymer Science: Part A, 2010, 48: 5961-5967.