独角莲中酪氨酸酶活性抑制成分的提取工艺研究

宋艳玲， 杜新春， 庞 颖， 殷连保， 张 毅， 戴宏斌

(沈阳化工大学 制药与生物工程学院， 辽宁 沈阳 110142)

独角莲(TyphoniumgiganteumEngl.) 为天南星科(Araceae) 犁头尖属(Typhonium Schott) 植物,是中国特有的一种植物，主要产于河南、四川、陕西等地，现全国各地亦多栽培，东北地区产量极高，且价格较低廉.《民间草药》、《中药大辞典》记载，独角莲球茎供药用，逐寒湿，祛风痰，镇痉，治中风痰壅、口眼歪斜、破伤风、跌打损伤、淋巴结核[1].迄今为止，对这种植物的使用多用于民间偏方，其有效活性成分的研究及应用仍处于开发阶段.文献报道，独角莲水提物对恶性肿瘤细胞增长具有明显的抑制作用[2-5].酪氨酸激酶在细胞内的信号传导通路中具有十分重要的作用，它和肿瘤的发生、发展、转移具有密切的关系，成为目前抗肿瘤药物的重要研究靶点[6-7].本实验对独角莲采用水提法提取，测定独角莲在不同提取工艺条件下的提取物对酪氨酸酶活性的相对抑制率,从中筛选出最佳的提取工艺.

1 实验材料与方法

1.1 实验仪器

721型分光光度计；DF1015-集热式磁力加热搅拌器；DHG-9070A电热恒温鼓风干燥箱；SHZ-D(Ⅲ)循环水式真空泵；电子分析天平.

1.2 实验材料

独角莲鲜球根茎(市售，产地为吉林)洗净，切成约5 mm的厚片， 经50 ℃烘干，粉碎,过100目筛，备用；L-酪氨酸(上海伯奥生物科技有限公司)；酪氨酸激酶(上海江莱生物科技有限公司).

1.3 实验方法

1.3.1 独角莲水提物的提取工艺研究

利用正交试验设计法，选取提取时间A、料液比B、提取温度C、提取次数D作为4个考察因素，每个因素选择3个水平，按照L9(34)正交表(表1)进行试验.以1号实验为例，称取独角莲粗粉50 g，置圆底烧瓶内，用5倍质量比的蒸馏水，在50 ℃提取1 h，提取次数1次.提取结束后，将提取液减压浓缩至干,置烘箱中干燥至恒质量,得干浸膏.其余试验按正交表设定的条件依次进行.

表1 独角莲水提物提取的正交试验设计

1.3.2 酪氨酸酶抑制活性测定

Folin试剂可与酪氨酸的酚羟基作用生成深蓝色化合物，该物质可以用比色法测定.酪氨酸如果被酪氨酸激酶分解，将不能与福林试剂发生显色反应，通过分光光度计测得的混合液的吸光度会有所降低.由于酶抑制剂的抑制活性不同，所形成的蓝色化合物量不同，通过测定吸光度的变化可计算样品对酪氨酸酶的抑制率.将上述各次提取实验所得到的浸膏分别称取10 mg置于10 mL容量瓶中，分别加蒸馏水溶解并稀释至质量浓度为1 g/L，备用.取1 mg酪氨酸酶用磷酸缓冲液稀释至5 mL备用.准确吸取pH6.8磷酸盐缓冲液1 mL、摩尔分数为0.2 %酪氨酸溶液1 mL及Folin试剂，开始反应，整个反应在37 ℃的恒温中持续20 min，于680 nm 处测定吸光度A0.在上述实验条件下，再分别准确吸取0.2 g/L酪氨酸酶试液1 mL、提取物样品和0.2 g/L酪氨酸酶试液各1 mL、提取物样品1 mL，分别进行反应后对应测定吸光度分别为A1、A2、A3.酪氨酸激酶的抑制活性可以按以下公式计算:

抑制率=[(A1-A0)-(A2-A3)]/(A1-A0)×100 %

式中:A0空白对照品所测的吸光度;A1添加酪氨酸酶混合液所测的吸光度;A2添加提取物和酶的混合液所测的吸光度;A3添加提取物样品混合液所测的吸光度.

2 结果与讨论

2.1 正交试验结果

正交试验结果见表2，从表2 得出最佳提取工艺条件为A3B3C2D1，即提取时间为3 h，料液质量比为1∶15，提取温度80 ℃，提取次数为1次的条件下，独角莲提取物对酪氨酸酶抑制活性较高.从表2中得到的极差大小可知:影响提取物抑制酪氨酸酶活性的主次因素顺序为C>B>D>A，即提取温度的影响最显著，其次为提取液用量，再次为提取次数，最后为提取时间.

按照正交试验结果所得到的最佳提取工艺条件，重复进行3组平行验证试验，结果见表3，表明此提取工艺合理，稳定，可行.

表2 正交试验结果

表3 正交试验结果验证

2.2 讨 论

正交试验结果表明：提取温度的控制对提取物抑制酪氨酸酶活性的影响较大.温度较低(50 ℃)情况下，有可能不利于独角莲中有效活性成分的提取，影响提取物抑制酪氨酸酶活性.温度过高(100 ℃)，提取物抑制率也有所下降，可能是由于高温使得部分活性化合物分解.提取液用量在料液质量比1∶5与1∶10之间对提取物抑制酪氨酸酶活性的影响较大，而对于料液质量比1∶10与1∶15之间对提取物抑制酪氨酸酶活性的影响较微弱，一般情况下，可选用料液质量比1∶10来减少资源的浪费.

3 结 论

设计正交试验,利用水提法对独角莲活性成分进行提取,并进行了酪氨酸酶抑制活性研究.结果表明：提取时间为3 h，料液质量比为1∶15，提取温度80 ℃，提取次数为1次的条件下，独角莲水提物抑制酪氨酸酶活性最强，抑制率为46.93 %.通过3组平行试验验证了该提取工艺的优化性.独角莲水提物作为一种有效的酪氨酸酶抑制剂，具有进一步研究开发的价值.

参考文献：

[1] 侯家玉.中药药理学[M].2版.北京:中国中医药出版社,2006:106.

[2] 王顺肩,倪虹,王娟,等.独角莲对肝癌细胞SMMC-7721细胞增殖抑制作用机理的研究[J].细胞生物学杂志,2003,25(3):185-187.

[3] 王顺启,倪虹,王问顺,等.独角莲水提取物对肝癌细胞SMMC-7721基因表达的影响[J].中草药,2006,37(9):1384-1387.

[4] 王林美,叶博,赵振军,等.独角莲抑制乳腺癌 MCF-7细胞增殖和诱导凋亡的作用研究[J].沈阳农业大学学报,2009,40(2):174-177.

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[7] 姜秋红,程能能,高慧君.以酪氨酸激酶信号通路为靶点的抗肿瘤药物研究进展[J].中国临床药学杂志,2011,20(6):379-383.