马立克氏病病毒河南分离株Meq基因的克隆与序列分析

余祖华,滕 蔓,丁 轲,闵亚杰,禹乐乐，宿靖伟，程相朝，罗 俊

(1 河南科技大学 动物科技学院 动物疫病与公共卫生重点实验室，河南 洛阳 471003；2 河南省农业科学院，农业部动物免疫学重点实验室，河南省动物免疫学重点实验室，河南 郑州450002；3 洛阳普莱柯生物工程股份有限公司，河南 洛阳 471003)

马立克氏病病毒(Marek’s disease virus,MDV)是一种能引起其自然宿主发生肿瘤的致瘤性疱疹病毒[1]，属于α疱疹病毒[2]，具有高度的接触传染性。MDV感染鸡后能引起马立克氏病(Marek’s disease,MD)，该病首次由Joszef Marek于1907年发现并报道[3]，是一种主要以淋巴组织增生性紊乱、神经性、免疫抑制性为主要特征的疾病。MDV共有3种血清型[2]，即MDV-1(Gallid herpesvirus 2，GaHV2)、MDV-2(Gallid herpesvirus 3，GaHV3)和MDV-3(Meleagrid herpesvirus 1，MeHV1)，其中GaHV2包括对宿主具有毒力或致瘤性的强毒分离株及其致弱变异株；GaHV3没有致病性；MeHV主要是火鸡疱疹病毒(Herpesvirus of turkeys，HVT)，也没有致病性，且可用于制备疫苗来预防MD。根据GaHV2毒株致病性的不同，可将MDV-1分为温和毒株(Mild MDV，mMDV)、强毒MDV(Virulent MDV，vMDV)、超强毒MDV(Very virulent MDV，vvMDV)以及特超强毒MDV(Very virulent plus MDV，vv+MDV)[4]。Meq基因是GaHV2毒株特有的基因，为MDV的致瘤基因，其N末端具有亮氨酸拉链结构(Basic region leucine zipper，bZIP)，C末端具有富含脯氨酸重复区(Proline-rich repeats，PRRs)的转录激活域[5-6]。迄今为止，MD的预防与控制仍需通过疫苗免疫来进行。但是，随着集约化养禽业的不断扩大，MDV对常规疫苗的抵抗力也在逐渐增加，且能突破MDV疫苗的免疫保护，因此在疫苗免疫鸡群中常发生野毒株的感染，且致病力也呈逐渐增强趋势。2011-2012年，河南省某些疫苗免疫鸡群发生较大规模的MD流行[7]，笔者对病例鸡进行了病毒分离，为了解这些分离株Meq基因的分子特性，本研究对17个MDV分离株的Meq基因进行了克隆测序，并将其与4种致病型MDV-1参考毒株进行了比较分析，旨在了解这些分离株的遗传变异特征及可能的致病性。

1 材料与方法

1.1 MDV毒株

17个MDV分离株分别为HNGS101、HNGS201、HNGS206、HNXZ101、HNXZ103、HNXZ106、HNLC107、HNLC202、HNLC203、HNLC401、HNLC502、HNLC503、HNLH302、HNLH303、HNLH304、 HNLH305和HNSC105，由河南省农业科学院动物免疫学重点实验室分离保存。MDV GX0101株为分离于中国广西产蛋鸡群的1株GaHV2野毒株，由山东农业大学崔治中教授馈赠。

1.2 主要试验材料

Premix Ex TaqTM、pMD19-T载体、E.coliJM109感受态细胞、DL2000 DNA Marker，均购自TaKaRa公司；DNA提取试剂盒、凝胶回收试剂盒，均购自北京天根生化科技有限公司。

1.3 参考毒株的Meq基因序列

4种不同致病性MDV-1Meq基因序列来自GenBank，其毒株及序列号分别为：mMDV CVI988(AF493555)和中国疫苗株814(AF493551)、vMDV GA(AF147806)、vvMDV RB1B(AY243332)、vv+MDV毒株648A(AY362725)。

1.4 分离株Meq基因的扩增

1.4.1 引物的设计与合成 根据GenBank 中发表的 MDV Md5株的全基因序列 (No.AF243438)，应用Primer primer5.0软件设计1对扩增Meq基因全序列的引物，预计扩增片段长度为1 020 bp，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

上游引物P1:5′-ATGTCTCAGGAGCCAGAG-3′(位于基因组134 867-134 884碱基处)；

下游引物P2:5′-TCAGGGTCTCCCGTCACC-3′(位于基因组135 869-135 886碱基处) 。

1.4.2Meq基因的PCR扩增 用DNA提取试剂盒提取各MDV分离株感染的鸡胚成纤维(Chicken embryo fibroblast,CEF)细胞总DNA，用去离子水调整DNA至质量浓度为100 ng/μL后，进行各分离株Meq基因的PCR扩增。同时以MDV GX0101株感染CEF细胞的总DNA为阳性对照，以CEF细胞总DNA为阴性对照。PCR反应体系为20 μL，其中包括ExTaq酶10 μL，10 pmoL/μL的上、下游引物各l μL，DNA模板1 μL，去离子水7 μL。PCR反应条件为：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性1 min，60 ℃ 复性1 min，72 ℃延伸2 min, 共30个循环；最后72 ℃延伸10 min。置于4 ℃保存。PCR扩增产物于10 g/L琼脂糖凝胶电泳后在凝胶成像系统下观察电泳条带大小。

1.5 Meq基因的克隆与测序

用凝胶回收试剂盒回收PCR产物，将其与pMD19-T载体于16 ℃连接过夜后，转化JM109感受态细胞，挑取在具有氨苄抗性的LB固体平板上生长的单克隆菌落，接种至具有氨苄抗性的LB液体培养基中振摇培养10～12 h，然后进行菌液PCR筛选阳性克隆。PCR鉴定阳性菌送样至上海生工生物工程有限公司进行测序。

1.6 Meq核苷酸及其编码氨基酸的序列分析

分别用DNAStar MegAlign软件和MEGA 4.0软件对各分离株和MDV参考毒株序列进行序列比对分析及遗传进化分析。

2 结果与分析

2.1 MDV分离株Meq基因的PCR扩增结果

经过PCR扩增，从17个MDV分离株中均扩增出特异性PCR产物，其中绝大部分分离株如HNGS101、HNXZ101和HNLC107等的PCR扩增产物与GX0101大小一致，片段长度约为1 020 bp，均与预期长度相符；另2个分离株HNGS201和HNLC503的PCR扩增产物较预期稍大，而阴性对照CEF细胞中未扩增出特异性产物(图1)。

图 1 MDV Meq基因的PCR扩增

2.2 MDV分离株Meq基因的核苷酸序列分析

序列分析结果表明，大部分毒株的Meq基因DNA序列大小均为1 020 bp，但分离株HNGS201 和HNLC503的长度分别为1 200 bp和1 197 bp。对分离株与MDV参考毒株Meq基因的ORF核苷酸序列进行分析比较，发现这些MDV分离株之间或分离株与参考毒株之间的核苷酸同源性为99.0%～100%。

2.3 MDV分离株Meq蛋白的氨基酸序列分析

将MDV河南分离株与各参考毒株的Meq基因推导的氨基酸序列进行比较分析，结果显示，分离株与参考株之间氨基酸存在一定的差异(图2)。河南分离株与MDV参考毒株Meq基因推导的氨基酸在71, 77, 80,115,119,139,153,176,180和217共10个位点存在突变，这些位点分别是71(S→A),77(K→E),80(D→Y),115(V→A),119(R→C),139(T→A),153(Q→P),176(P→R),180(A→T)和217(P→A)，大部分毒株在有些位点存在相似的突变。分离株HNGS201、HNLC503、HNLH304与mMDV 疫苗株CVI988、814具有相似的突变位点。vv+MDV 648A在119,153,176,180具有独特的突变位点，分别是119(C→R),153(P→Q)，176(R→A)和180(T→A)。分离株HNGS101、HNGS206、HNLC107、HNXZ101、HNXZ103、HNXZ106、HNLC502、HNSC105 第139位的T突变成了A。除HNGS201、HNLH304和 HNLC503外，其他河南分离株176位的氨基酸突变为R而217/277位的氨基酸突变为A。HNGS201 和 HNLC503分别在194～253、194～252之间有60个氨基酸和59个氨基酸的插入(图2)。

图 2 MDV河南分离株与参考毒株Meq基因编码的氨基酸序列的比较

2.4 MDV河南分离株Meq基因的遗传进化分析

用MEGA(version4.0)分析软件构建MDV河南分离株和参考毒株的Meq基因系统进化树(图3)，发现这些分离株和参考株共组成了3个分支，其中国外强毒株GA、RB1B和648A单独形成一个分支；绝大部分河南分离株如HNXZ101、HNGS101和HNLH302等组成一个较大的分支，而另外3个河南分离株HNGS201、HNLH304和HNLC503与mMDV 毒株CVI988和814位于同一分支上。

3 讨 论

近年来，MDV毒力不断增强并出现了vv+MDV的流行[4]，但目前仍不清楚MDV野毒株毒力增强的主要原因。有研究者认为，毒力增强可能与免疫鸡群中MDV 毒力基因复制过程发生突变有关[8]。某些MDV毒株测序结果表明，MDV的毒力可能与Meq基因显著的多态性和点突变有关，破坏PRRs伸展的突变株往往有较高的毒力，且PRRs突变的次数越多毒力越强[9-11]。也有研究表明，Meq蛋白C末端转录激活区的A217和N末端亮氨酸拉链区的E77、Y80、A115的独特突变与Meq蛋白的转录激活增强有关，且115位点或碱性区域2(Basic region 2，BR2)的突变可能比PRRs突变的影响更大[12-13]。施维松等[14]研究发现，有3株中国分离毒株的Meq在139、176、217位氨基酸均发生了突变，并且有2处变化是近几年国内分离毒株特有的。本研究中使用的强毒、超强毒、特超强毒的几个参考毒株在E77、Y80、A115、A217均有相似的突变位点，且具有较近的遗传进化关系，这些氨基酸的突变可能影响Meq的转录激活且与毒株的毒力有一定关系。毒力最强的参考株648A在153和176位有2次突变破坏PRRs的伸展。而河南分离株中，HNLC202、HNLC203、HNLC401、HNGS101、HNGS206、HNLC107、HNXZ101、HNXZ103、HNXZ106、HNLC502、HNSC105等11个分离株在176和217位均有2 处突变破坏PRRs的伸展，HNLH302、HNLH303、HNLH305仅在217位1处突变破坏PRRs的伸展，这一突变是否与其毒力有关，还需进一步研究。另外，HNGS101、HNGS206、HNLC107、HNXZ101、HNXZ103、HNXZ106、HNLC502、HNSC105等8株河南分离株均具有一个独特的A139替换，这个位点的氨基酸突变是否与其毒力有关，还需要开展更多的研究来证实。Meq基因系统发生树分析表明，河南分离株HNGS201、HNLH304和HNLC503与mMDV 弱毒疫苗株CVI988、814位于同一分支,且它们的氨基酸突变位点也基本一致，说明这些分离株有可能是疫苗变异株或弱毒变异株。

图 3 MDV Meq基因的系统进化树

Meq基因内富含脯氨酸重复区的59个或60个氨基酸编码基因的扩增，主要出现在较低毒力的MDV毒株中，如CVI988 和CU-2[9]，但对澳大利亚和波兰的MDV分离株的研究表明，这种插入也可能发生在强毒株[15-16]。也有研究表明，MDV致弱毒株Meq基因片段比致瘤毒株的片段长[17]。本研究发现，仅在HNGS201和HNLC503这2株可能为mMDV的毒株内出现Meq基因177或180 bp碱基的插入，而强毒株或其他弱毒株如HNLC304与疫苗株814株并没有插入。177或180 bp碱基的插入是否可以作为区分强弱毒株的参考及其在MDV致病性方面的潜在作用值得进一步研究。本研究结果表明，在河南省的鸡群中可能流行着不同毒力的MDV，一些毒株的Meq基因存在177或180 bp碱基的插入，这些毒株可能是mMDV毒株，但还需通过动物试验来进一步验证。本研究为河南省MDV的流行情况提供了重要的参考信息，同时也为今后更好地防控MD奠定了基础。

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