中国仓鼠卵巢细胞和人胚肾T细胞骨架及其迁移特性的比较

张 伟，胡新德，王久涛，宋玲珍，李玲玲，陈树林，赵善廷

(西北农林科技大学 动物医学院，陕西 杨凌 712100)

细胞骨架是位于细胞内的一种纤维状蛋白，由微丝、微管及中间丝组成，三者高度协调分布，与细胞的形态特点、能动性、细胞分裂及细胞内小泡和细胞器的运输等生理活动密切相关。由于中间纤维相对微管、微丝较为稳定，本研究以相对活跃的微管、微丝及其黏着斑为重点，详细比较了CHO和HEK293T细胞系的整体形态特点、细胞骨架的差异及其相互间的关系，以期为阐明其适用性奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

胎牛血清购自Hyclone公司，D-MEM/F-12、Opti-MEM购自Gibco公司，mouse anti-Vinculin antibody、TRITC-conjugated phalloidin和DAPI均购自Millipore,mouse anti-α-Tubulin antibody购自Sigma公司，mouse anti-β-Actin antibody (C4)购自Santa cruz biotechnology,LipofectamineTM2000和goat anti-mouse IgG Alexa 488购自Invitrogen 公司，goat anti-mouse IgG (HRP Conjugated)购自康为世纪,倒置荧光显微镜Axio Observer Z1购自蔡司公司，CHO细胞系、HEK293T细胞系、pCAG-EGFP质粒由西北农林科技大学神经生物学研究室保存。

1.2 细胞培养及转染

CHO和HEK293T细胞在富含体积分数10%胎牛血清和青链霉素(100 U/mL 青霉素和100 U/mL 链霉素)的DMEM/F12(体积比1∶1)培养基中生长，将培养皿置于37 ℃、体积分数5% CO2培养箱中培养，当细胞融合度达到80%时，用质量分数0.25%的胰酶消化并1∶10传代，以保证细胞良好的生长状态。细胞转染参照LipofectamineTM2000的使用说明进行。

1.3 CHO和HEK293T细胞骨架的比较

1.3.1 细胞骨架的形态观察 待爬片上的细胞长至25%～40%时，经质量分数4%多聚甲醛固定、体积分数0.1% Triton X-100透化，用体积分数1%的正常羊血清封闭，中间漂洗用0.1 mol/L PBS。PBS漂洗后的爬片，在体积比为1∶1 000的mouse anti-Vinculin antibody 中4 ℃过夜孵育，用于标记黏着斑；或在体积比为1∶1 000的mouse anti-α-Tubulin antibody中4 ℃过夜孵育，用于标记微管。再用PBS漂洗后，用体积比为1∶300的goat anti-mouse IgG Alexa 488室温孵育2 h；漂洗后，再在体积比为1∶4 000的TRITC-conjugated phalloidin 中室温孵育2 h，用于标记微丝；经PBS漂洗，用体积比为1∶500的DAPI复染2 min标记细胞核。用抗荧光萃灭剂(Dako)封漂洗后的爬片，置于蔡司倒置荧光显微镜Axio Observer Z1下观察拍照。

1.3.2 核质比测量 将爬片上的细胞置于蔡司倒置荧光显微镜Axio Observer Z1 63X镜下观察，用体积比为1∶4 000的TRITC-conjugated phalloidin标记细胞轮廓，体积比为1∶500的DAPI复染细胞核。分别选取合适的细胞40个，若该细胞核是圆形，直接测量细胞核直径；若该细胞核是椭圆形，测量其长直径。再从中选取30个细胞测量细胞及细胞核直径c或长短直径a和b，测量软件为Axio Observer Z1自带。计算细胞及细胞核体积，公式如下：圆形V=4/3×π×(c/2)3，椭圆形V=4/3×π×(a/2)×(b/2)2；核质比N/D=Vn/(Vc-Vn)(式中，Vn是细胞核体积，Vc是细胞体积)。

1.4 CHO和HEK293T细胞迁移特性的比较

1.4.1 细胞的活动能力 绿色荧光蛋白(GFP)在细胞中弥散分布，可有效标记出细胞的整体轮廓，展示细胞骨架的动态变化。待培养皿中的细胞长至60%～70%时，利用LipofectamineTM2000转染pCAG-EGFP质粒标记待观察细胞，24 h后置于活细胞工作站借助蔡司倒置荧光显微镜Axio Observer Z1实时动态观察细胞变化。随机选取转染后显绿色荧光蛋白的阳性细胞，每隔6 min自动拍摄一张照片，共19 min。细胞核光透射率低，被转染细胞光密度最大处即为细胞核位置，以星号表示。

1.4.2 细胞的迁移能力 细胞接种在35 mm培养皿中，待细胞融合度达90%以上时，用Eppendorf黄色吸头沿培养皿直径划一条直线，并用PBS冲洗净直线上的细胞，换用DMEM无血清培养基培养。将培养皿置于蔡司倒置荧光显微镜Axio Observer Z1下，随机选取4个视野于镜下观察并拍照，并对观察视野做好标记。然后将培养皿置于37 ℃、5% CO2培养箱中继续培养，48 h后取出于显微镜下再次观察同样的视野。利用Axio Observer Z1显微镜自带软件对迁移前后的距离进行测量。迁移距离以迁移前后特定位置划痕两边界距离的差值计算。

1.5 α-Tubulin和β-Actin蛋白表达的免疫印迹分析

用直径60 mm培养皿分别培养CHO和HEK293T细胞，待细胞融合度达90%以上时，倒掉细胞培养液，PBS漂洗后，直接用细胞刮铲收集细胞，并以组织细胞裂解液(50 mmol/L Tris-Cl,pH 7.4,150 mmol/L NaCl,体积分数1% Triton X-100,质量分数1% Sodium Deoxycholate,质量分数0.1% SDS,Sodium Orthovanadate,Sodium Fluoride,EDTA 和 1 mmol/L PMSF)裂解细胞，收集裂解物。变性后的蛋白经SDS-PAGE电泳，以预染的蛋白Marker为标记，切取目的条带凝胶。以质量分数5%脱脂奶粉封闭含目的条带的PVDF膜，经封闭液1∶1 000(体积比)稀释的mouse anti-β-Actin antibody (C4)和mouse anti-α-Tubulin antibody 4 ℃过夜孵育后，以HRP偶联的1∶2 000(体积比)goat anti-mouse IgG室温孵育2 h。利用化学发光凝胶成像系统检测免疫印迹蛋白条带，并用Image J软件对条带灰度值进行分析，测出条带整合光密度。

1.6 数据统计分析

试验中采取3个独立重复对数据进行统计，以“平均值+标准差”表示。2组数据间比较用GraphPad Prism v5.0软件进行t检测，以P<0.05记为“*”，P<0.01记为“**”，P<0.001记为“***”。

完成这次采访任务可不简单，“一个人就像一支队伍”，一下子采访了这么多艺术家和小演员，实在是又忙又欢乐。我真切地感受到一场跨国演出幕后的艰辛，大人与孩子们之间互相尊重、彼此信任是多么重要呀！

2 结果与分析

2.1 CHO和HEK293T细胞形态及其细胞骨架特点

CHO细胞呈不规则形，胞体较大，胞浆丰富，轮廓清楚(图1)；细胞核卵圆形，位于胞质中央，细胞密集时呈长梭形，无伪足或伪足较少，细胞稀疏时伸出伪足(图1)。HEK293T细胞也呈不规则形，胞体较小，有圆形或椭圆形的核(图2)。细胞之间通过刷缘状的微绒毛及伪足连接，呈铺路石样镶嵌排列(图2)。

图 1 CHO细胞中微丝、微管及黏着斑的免疫荧光分析

图 2 HEK293T细胞中微丝、微管及黏着斑的免疫荧光分析

CHO与HEK293T细胞核直径无明显差别(图3-A)，但核质比为HEK293T大于CHO细胞，且差异极显著(图3-B)。

图 3 CHO和HEK293T细胞核直径与核质比的比较

CHO细胞经TRITC-conjugated phalloidin标记的肌动蛋白微丝(F-actin)位于细胞质及伪足中，平行排列的应力纤维终止于细胞边缘 (图1-A,白色箭头)；微管组织中心(MTOC)发出大量微管散向四周(图1-B)，和微丝一起构成了CHO细胞的主要骨架网络；同时，细胞表面有很多长短不一的伪足出现(图1-A和B)。HEK293T细胞的F-actin富集于细胞周边，而黏着斑弥散分布(图2-A)；微管高度密集分布于细胞边缘围绕着细胞核，部分微管进入片状伪足中(图2-B,白色短箭头)；细胞表面存在伪足和微绒毛(图2)。

2.2 CHO与HEK293T细胞活动能力的比较

CHO细胞突起变化明显，生长锥持续性改变(图4中标白色箭头处)；1 min时细胞一端有生长锥，随后生长锥快速消失，细胞核位置随着生长锥的变化也在改变(图4标“*”处)，并且胞体和尾部有收缩现象(图4)。HEK293T细胞突起也有变化，19 min内在细胞主突起分支上又产生新的突起，并且继续有胞内成分向突起处转运聚集(图4中标白色箭头处)，但速度较慢且短时间内细胞核位置相对稳定(图4标“*”处)。由此可知，CHO细胞的活动能力较HEK293T细胞强。

图 4 CHO和HEK293T绿色荧光蛋白阳性迁移细胞的延时成像分析

2.3 CHO与HEK293T细胞迁移能力的比较

为进一步比较CHO和HEK293T细胞的迁移能力，采用划痕试验在48 h内对2种细胞的迁移速度进行定量。结果(图5)显示，CHO划痕后0 h边缘平整，间隙很大；48 h后大量边缘细胞占据划痕很大区域，并且细胞呈现向内继续运动的趋势。HEK293T细胞划痕48 h前后变化不大，仅占据划痕很少区域，且边缘细胞向内运动趋势不明显。2种细胞均有一定的运动能力，但CHO细胞的运动能力更强，其细胞迁移速度约是HEK293T的2.9倍，二者差异极显著(P<0.001)。

图 5 CHO和HEK293T细胞的迁移速度(A)及迁移距离(B)比较

2.4 CHO与HEK293T细胞骨架结构基因的表达差异

人与小鼠基因有高度的同源性，本研究发现，人与小鼠结构基因微管组成成分α-Tubulin的氨基酸同源性为96.84%，微丝组成成分β-Actin的氨基酸同源性高达100%。遗传信息的高度一致性决定了其功能的一致性，但是本研究发现，CHO和HEK293T细胞中微管、微丝的基本结构组分α-Tubulin和β-Actin的相对含量存在很大差别(图6)，CHO细胞中二者光密度比值是HEK293T中的1.2倍。

图 6 CHO、HEK293T细胞中α-Tubulin和β-Actin蛋白的表达差异

3 讨 论

细胞运动依赖于细胞伪足在细胞前沿的聚合，前端伪足与基质结合提供拉动胞体前进的动力，同时还依赖于胞体和尾部的收缩[5-6]。本研究发现，CHO细胞中有应力纤维，而应力纤维主要存在于静态的细胞中[7]， 抑制细胞迁移[8]。有报道称，静态细胞微管延伸至细胞边缘，动态细胞如黑素瘤细胞在前进的片状伪足中极少有微管[9-10]。本实验中，CHO细胞微管发散至周边，少数进入伪足;而在HEK293T中微管富集在细胞周边，多数进入伪足；同时，延时成像和划痕试验证实，2种细胞系均具有动态性，但CHO细胞的运动能力更强。综上所述，CHO细胞虽比HEK293T细胞运动能力强，但受细胞骨架结构的影响，CHO细胞属于有轻微运动能力的细胞。

细胞核和细胞质是细胞分化的内在因素，细胞核提供特异的mRNA及其他核酸分子的合成模板，而细胞质中的核蛋白体含有几乎全部蛋白质合成所需要的成分，细胞质对基因的表达起调节作用。本研究通过对CHO和HEK293T细胞的细胞核直径和核质比的统计分析发现，CHO细胞核体积与HEK293T细胞核相似，而CHO细胞的核质比小于HEK293T细胞，预示着2种细胞基因存在着选择性表达，这与2种细胞系α-Tubulin/β-Actin蛋白相对含量存在很大差别一致。

CHO与HEK293T细胞在细胞形态、迁移方面的差异除受微管、微丝相对含量及其分布的影响外，还取决于微管、微丝间的相互作用。Vasiliev等[11]发现，在运动的纤维母细胞前沿，完整的微管骨架可以维持肌动蛋白依赖的突起的极性分布，这种互作的细胞分子基础是“张拉整体模型”[12-13]。微管、微丝的互作方式有2种：一种是通过信号级联反应相互影响，另一种是结构上的直接作用[14]。微管、微丝通过信号级联反应相互影响最典型的例子是，小G蛋白中的Rho家族成员作为中间媒介实现微管、微丝的相互影响[15]；如RhoA介导肌动蛋白应力纤维的组装[16]，同时促使局部微管的稳定[17]；同样，Rac1可调节微丝、微管的聚合，促进伪足突起的形成[18-19]；且Rho的活性也可被微管、微丝调控，微管或微丝的分解可激活RhoA[20]，而微管的组装可促进Rac1的活性[21]。对于微管、微丝结构上的直接互作，有研究在非洲爪蛙卵提取物中观察到了微管、微丝在静态和动态下的相互作用[22]：静态下的相互作用可由微管、微丝结合蛋白复合体或单个同时结合2种结构的蛋白介导，而动态下的相互作用可能涉及微管或微丝依赖的动力蛋白和微管或微丝的结合蛋白，亦或是复合体。

本研究从CHO和HEK293T细胞的形态和迁移特性着手，对比描述了二者的细胞骨架结构和运动特点，加深了对2种细胞系的认识。结果显示，CHO与HEK293T细胞相比，细胞骨架活动性强，迁移速度快且结构清晰。因此，CHO细胞可用于细胞骨架形态研究和对细胞迁移能力影响的模拟试验，而HEK293T细胞不适于此类研究。

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