灵芝多糖的提取纯化及其免疫活性

张丽霞，张雅君，张丽萍

(1 大庆师范学院 生命科学学院，黑龙江 大庆 163712；2 仲恺农业工程学院 生命科学学院，广东 广州510225；3 东北师范大学 生命科学学院，吉林 长春 130024)

药用真菌多糖是从真菌子实体、菌丝体、发酵液中分离出来的一种多糖[1-2]，具有调节免疫[3-4]、抗肿瘤[5]、抗病毒[6]、抗衰老[7]、抗放射[8]、抗凝血[9]等多种药理活性，是公认的安全低毒活性物质。大量研究证明，真菌多糖不仅能够激活小鼠脾淋巴细胞、腹腔巨噬细胞和自然杀伤细胞等免疫细胞，还能活化补体，促进细胞因子的生成，对免疫系统具有多途径、多层面的调节作用[10]。真菌多糖作为良好的药物资源，已成为继蛋白质和核酸之后的又一科学研究热点[11]。

灵芝古称瑞草，隶属于担子菌亚门层菌纲非褶菌目灵芝菌科灵芝属[12]，是我国传统的补益中药，具有扶正固本、延年益寿之功效[13]。目前，有关灵芝孢子粉纯多糖的免疫调节作用研究还未见报道。为此，本研究以灵芝孢子粉为试验材料，提取灵芝水溶性粗多糖，分离纯化后对其理化性质及免疫活性进行研究，以期为灵芝多糖的开发利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

灵芝孢子粉购自辽宁百发生物制品有限公司。ICR雄性小鼠，体质量(20.0±2.0) g/只，购于吉林大学药理学实验中心，自由进食。

Sepharose CL-6B，Pharmacia Biotech公司生产；MTT、脂多糖(LPS)、刀豆蛋白A (ConA)，Sigma公司产品；中性红，Amersco公司产品；RPMI1640培养基，Gibco公司产品；新生牛血清，杭州四季青公司产品；Mouse TNF-alpha ELISA Kit，ADI公司产品；iNOS测定试剂盒，南京建成生物工程研究所生产；其余化学试剂均为国产分析纯试剂。

超低温冰箱、二氧化碳培养箱，SANYO Electric Company 公司生产；高效液相色谱仪，日本岛津苏州公司生产；Varian 3400气相色谱仪，美国Varian公司生产；医用型洁净工作台，北京东联哈尔仪器制造有限公司产品；酶标仪，Bio-RAD 公司生产；倒置显微镜，IXTO OLYMPUS公司生产。

1.2 试验方法

1.2.1 灵芝多糖的提取与纯化 称取灵芝孢子粉1 000 g，经石油醚(60～90 ℃)回流脱脂后，再用体积分数70%甲醇抽提20 h，抽滤。将残渣加蒸馏水浸泡过夜，沸水煮提3次，1 h/次，离心(4 000 r/min，15 min)，合并3次煮提滤液，减压浓缩至200 mL，加3倍体积的体积分数95%乙醇醇析过夜，离心(4 000 r/min，15 min)，常规干燥得灵芝粗多糖。

将灵芝粗多糖配成质量分数为5%的溶液，置于-20 ℃冰箱冷冻过夜，室温缓慢融化，高速冷冻离心(8 000 r/min，10 min，4 ℃)，重复此操作5次，直至无沉淀产生。采用Sevag法[14]对样品脱蛋白，重复多次，至无游离蛋白为止。通过Sepharose CL-6B 柱层析( 1.5 cm×100 cm) 对样品进行分析，用质量分数0.9% 氯化钠溶液洗脱，自动部分收集器收集，酚-硫酸法[15]检测糖的分布。

采用Separose CL-6B 柱(2.5 cm×90 cm)层析制备灵芝多糖，用质量分数0.9%的NaCl溶液进行洗脱，收集糖峰洗脱液，依次进行流水逆向透析(24 h)和蒸馏水透析(24 h，每4 h换蒸馏水1次)脱盐，然后水浴(80 ℃)浓缩，冻干过夜，即得纯化的灵芝多糖(GLP)。

1.2.2 GLP相对分子质量的测定及组成分析 精确称取3 mg GLP溶于1 mL质量分数0.7% 硫酸钠溶液中，超声波处理5 min，过滤后进行高效液相色谱(HPLC)分析(洗脱液流速0.6 mL/min)。采用气相色谱法(G.C.)[16]测定GLP糖组成。

1.2.3 GLP的免疫活性 (1)GLP对脾淋巴细胞体外增殖的影响。参考文献[17]制备小鼠脾淋巴细胞悬液。将脾淋巴细胞悬液加入96孔细胞培养板中，每孔100 μL，设空白对照(CK)孔、ConA(5 μg/mL)对照孔、LPS(10 μg/mL)对照孔、待测糖液(质量浓度为50，100，200和400 μg/mL)孔、待测糖液(质量浓度为50，100，200和400 μg/mL)+5 μg/mL ConA 50 μL孔和待测糖液(质量浓度为50，100，200和400 μg/mL)+10 μg/mL LPS 50 μL孔，每孔总体积为200 μL，混匀后放入37 ℃培养箱中培养72 h，培养结束前4 h，每孔加入MTT液(5 mg/mL)20 μL，培养结束时每孔弃去100 μL上清，加入150 μL二甲基亚砜，用酶标仪在570 nm处检测其吸光度(OD570)，每处理设3个重复孔。

(2)GLP对腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响。参考文献[17]制备小鼠腹腔巨噬细胞。将纯化后的腹腔巨噬细胞加入96孔细胞培养板中，同时加入质量浓度为50，100，200和400 μg/mL待测糖液(200 μL/孔)，同时设空白对照、LPS(20 μg/mL)阳性对照，培养24 h后吸去上清，每孔加入100 μL质量分数为0.075% 的中性红溶液，继续培养1 h，用PBS(pH7.4)洗去剩余的中性红后，加入100 μL的细胞裂解液(V(乙醇)∶V(乙酸)=1∶1)，24 h后用酶标仪在波长550 nm处检测其吸光度(OD550)。

(3)GLP对腹腔巨噬细胞产生NO的影响。精确称取NaNO269.0 mg，加蒸馏水溶解定容至1 L，配制成1 mmol/L NaNO2溶液备用。用移液管分别吸取1，0.9，0.8，0.7，0.6，0.5，0.4，0.3，0.2和0.1 mL NaNO2溶液于10 mL离心管中，补加水至10 mL。取上述各溶液100 μL，加入96孔酶标板中，加入等体积的Griess试剂，10 min后用酶标仪于波长540 nm处检测。以NaNO2浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。

纯化腹腔巨噬细胞，以2×106mL-1加入24孔板中，同时设空白对照和LPS(20 μg/mL)阳性对照，加入质量浓度为50，100，200和400 μg/mL的待测糖液培养24 h后，吸取细胞培养上清液(100 μL)转移至另一培养板中，并加入等体积的Griess试剂，10 min后于波长540 nm处用酶标仪检测，根据NaNO2标准曲线，计算NO的产量。

(4)GLP对腹腔巨噬细胞诱导型一氧化氮合酶(iNOS)活性的影响。取100 μL腹腔巨噬细胞培养上清液，通过比色法测iNOS的酶活力，具体操作按照iNOS试剂盒说明进行。同时设20 μg/mL的LPS为阳性对照组。

(5)GLP对腹腔巨噬细胞产肿瘤坏死因子(TNF-α)的影响。将纯化的腹腔巨噬细胞以2×106mL-1加入24孔板中，加质量浓度为50，100，200和400 μg/mL待测糖液培养24 h后，吸取细胞培养液上清100 μL，用ELISA试剂盒检测TNF-α。同时设20 μg/mL的LPS为阳性对照组。

1.3 数据统计分析

试验数据以“平均值±标准差”表示；对数据进行单因素方差分析，P<0.05表示有显著差异，P<0.01 表示有极显著差异。

2 结果与分析

2.1 灵芝多糖的提取纯化及其理化性质

从1 000 g灵芝孢子粉中获得6.6 g水溶性粗多糖，纯化后得GLP，通过HPLC检查其纯度发现，GLP为单一狭窄对称峰，确定其可以用于后续活性试验。GLP为白色粉末，易溶于水，相对分子质量为5.1 ku，糖含量为89.4%。气相色谱分析结果(图1)表明，GLP的单糖组成为葡萄糖(Glc)和半乳糖(Gal)，其物质的量比为16.8∶1.0。

图1 灵芝多糖的气相色谱图

2.2 GLP对脾淋巴细胞体外增殖的影响

GLP对脾淋巴细胞的促增殖作用见图2。

图2 灵芝多糖对脾淋巴细胞体外增殖的影响

由图2可知，50～400 μg/mL GLP单独作用时，能不同程度地促进脾淋巴细胞增殖，且与CK相比，差异达显著水平(P<0.05)。GLP能促进ConA诱导的T淋巴细胞的增殖，不能促进LPS诱导的B淋巴细胞的增殖；与ConA对照相比，50～400 μg/mL GLP与ConA协同作用效果均达到极显著水平(P<0.01)，并具有剂量依赖性。

2.3 GLP对腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响

将小鼠腹腔巨噬细胞和不同质量浓度的GLP(50～400 μg/mL)加入到96孔细胞培养板中培养24 h，结果(图3)表明，GLP能够激活腹腔巨噬细胞，增强其吞噬功能。当GLP的质量浓度为50～100 μg/mL时，可显著促进腹腔巨噬细胞的吞噬功能；当其质量浓度为200～400 μg/mL时，可极显著促进腹腔巨噬细胞的吞噬功能；GLP质量浓度为 50～400 μg/mL时，其对腹腔巨噬细胞吞噬功能的促进作用与LPS差异未达到显著水平。

2.4 GLP对腹腔巨噬细胞NO产量及iNOS活性的影响

根据Griess法，得到OD540(y)与NaNO2质量浓度(x)的标准方程为：y=0.054 8x+0.071 7。测定样品的OD540值，通过标准方程计算NO的产量，结果(图4)表明，GLP质量浓度≥100 μg/mL时，能显著或极显著增强腹腔巨噬细胞产生NO的能力；当GLP质量浓度为400 μg/mL时，腹腔巨噬细胞产生的NO量最高，接近于阳性对照组(LPS，20 μg/mL)。

图3 灵芝多糖对腹腔巨噬细胞吞噬作用的影响

由图5可知，GLP质量浓度≥100 μg/mL时，能显著或极显著增强腹腔巨噬细胞分泌iNOS的活力；当GLP质量浓度为400 μg/mL时，腹腔巨噬细胞分泌iNOS的活力最高，但仍低于LPS(20 μg/mL)阳性对照组。

2.5 GLP对腹腔巨噬细胞产生TNF-α的影响

灵芝多糖对腹腔巨噬细胞产生TNF-α的影响结果见图6。

图5 灵芝多糖对腹腔巨噬细胞iNOS活性的影响

腹腔巨噬细胞产生的TNF-α是机体免疫反应和杀伤肿瘤细胞的关键调节因子。GLP对腹腔巨噬细胞产生TNF-α的影响结果(图6)表明，当GLP质量浓度≥200 μg/mL时，腹腔巨噬细胞产生的TNF-α与CK相比极显著增加(P<0.01)；当GLP质量浓度为400 μg/mL时，腹腔巨噬细胞产生的TNF-α最多，但仍低于LPS(20 μg/mL)阳性对照组。

3 讨 论

真菌多糖作为重要的生物应答调节剂，对机体的先天免疫系统具有重要的调节作用。脾脏是淋巴细胞定居和接受抗原刺激产生免疫应答的重要场所。活化的腹腔巨噬细胞吞噬功能明显增强，还能够释放TNF-α、NO等细胞因子。诱导型iNOS的合成是对腹腔巨噬细胞产生特异性免疫的应答反应。大量的研究表明，真菌多糖不仅能够激活T、B淋巴细胞、腹腔巨噬细胞等免疫细胞，还能促进细胞因子的生成，对免疫系统发挥多方面的作用。本试验结果表明，从灵芝孢子粉中提取纯化的活性物质灵芝多糖，能够促进T淋巴细胞的增殖，显著增强腹腔巨噬细胞的吞噬功能，提高其分泌iNOS的活力和NO的生产量；同时还能促进腹腔巨噬细胞产生TNF-α，这可能是灵芝多糖增强机体免疫力的重要机制之一。灵芝多糖的免疫活性与其单糖组成、糖苷键类型、分子质量大小、分子结构等都有密切关系，为了阐明灵芝多糖的免疫调节机制，还需对其构效关系进行深入研究。

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