平欧杂交榛抗寒生理特性研究

韩俊威，董玉芝，宋锋惠，史彦江，韩 强

(1 新疆农业大学 林学与园艺学院，新疆 乌鲁木齐 830052；2 新疆林科院 经济林研究所，新疆 乌鲁木齐 830063)

榛子为桦科(Corylaceae)榛属(Corylus)植物，全球约有16个种，中国天然分布的有8个种和2个变种。自20世纪90年代末平欧杂交榛(Corylusheterophylla×Corylusavellana)选育成功后，已逐渐取代平榛(C.heterophylla)和欧洲榛(C.avellana)成为我国北方的主要栽培种[1]。榛子营养丰富，其果仁含油量47%～68%，含蛋白质23%，脂肪56%～65%，淀粉6.6%，还含有维生素A、B、E以及铁、钙等矿质元素，具有极高的营养价值和经济价值[2]。新疆地处欧亚大陆腹地，具有丰富的光、热资源，与平欧杂交榛原产地(东北地区)有相似的地理纬度和生态环境，新疆林科院自2001年开始从东北地区引进平欧杂交榛，这不仅丰富了新疆的坚果种类，而且可促进当地的经济发展[3]，增加农民的经济收入；同时，种植榛树还能固结土壤、涵养水源，起到水土保持的作用[2]，有助于改善新疆种植区的土壤和水环境，因此杂交榛在新疆的种植发展前景较好。平欧杂交榛可以在北纬42°以南良好生长，耐低温；而在北纬42°～47°会出现冻害、抽条等现象[4]。新疆北部地区处于此纬度区间内，冬季较长，温度较低，易出现极端低温，果树常会遭受不同程度的冻害，影响产量，给生产带来损失。由于新疆独特的气候地理和环境因素，使得该区域发展榛子经济有很大潜力，然而该树种的冻害、抽条等问题成为其大面积推广的一个制约因子。因此，研究榛子抗寒性生理特性和选育高抗寒性榛子品种尤为重要。

目前，关于果树的抗寒适应性已有不少报道，如对梨[5]、扁桃[6]、樱桃[7]、葡萄[8]、杏[9]、枣[10]等的抗寒性研究，不仅探究了低温胁迫使得质膜透性改变或丧失而使其透性增大的原因[11]，而且也对渗透调节物质及酶活性等指标在低温胁迫下的变化规律有了一定认识。但迄今有关榛子的抗寒研究，特别是对引种到新疆的杂交榛抗寒性方面的研究报道还很少。

为了深入研究杂交榛的抗寒生理特性，本试验以平欧杂交榛4个品种的1年生休眠枝条为试验材料，在不同低温条件下处理24 h，对其电解质渗出率、丙二醛含量、游离脯氨酸含量、过氧化物酶活性及萌芽率等指标进行测定，研究各项抗寒生理指标在低温胁迫下的变化情况，分析其与低温的相关性，以期筛选出抗寒性较强的品种，为杂交榛的高抗寒性育种和栽培提供依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

2013-01上旬在新疆伊犁州霍城县大西沟乡果树站榛子资源汇集圃采集平欧杂交榛品种新榛1号(84-254)、新榛2号(82-11)、新榛3号(84-310)和平顶黄(80-43)的枝条，选取植株中上部、充分成熟、无病虫害、粗度接近、长度为30～40 cm的1年生枝条作为试材，所选枝条的朝向和部位尽量一致，用凡士林涂抹剪口，按品种贴上标签装入聚乙烯袋中，带回实验室，贮存于0～4 ℃冰箱内。

1.2 方 法

1.2.1 低温胁迫处理 将采回的1年生枝条剪成30 cm长的小段，用自来水、蒸馏水冲洗干净，再用吸水纸吸干水分，放入密封袋内。将每个品种分成6份，每份有6根枝条，用干净纱布包裹放入塑料袋中，置于可控超低温冰箱中进行人工低温处理，设-15(对照)，-20，-25，-30，-35和-40 ℃共6个低温梯度，冷冻时的降温幅度和解冻时的升温幅度均为4 ℃/h，冷冻降温到处理温度时，维持24 h，然后解冻，室温下放置2 h后，进行有关生理指标的测定。

1.2.2 生理指标测定 (1)电解质渗出率。参照王飞等[12]的方法并加以改进：将处理后的枝条剪成约2 cm长的小段(避开芽眼)，放置于铺有去离子水润湿滤纸的培养皿中，用电子天平称取1 g样品，放入三角瓶中(每个处理重复3次)，标记后加入20 mL去离子水，在室温下浸提12 h，用DDS-307型电导率仪测定浸提液煮沸前的电导率，然后将样品置于沸水浴中煮沸15 min，将浸提液定容至20 mL，待冷却至室温时，摇匀，测定浸提液煮沸后的电导率，用下式计算电解质渗出率：

电解质渗出率=煮沸前的电导率/煮沸后的电导率×100%。

(2)丙二醛(MDA)含量。采用硫代巴比妥酸比色法测定[13]，分别在波长450，532和600 nm下测定其吸光度值，计算其含量。

(3)游离脯氨酸(游离Pro)含量。采用茚三酮法[14]测定。

(4)过氧化物酶(POD)活性。采用愈创木酚法[13]测定。

(5)萌芽率。将处理后的枝条扦插于温室(温度20～25 ℃)花盆内，每个花盆内扦插6根枝条，以体积比为1∶1的蛭石和珍珠岩作为基质，每处理重复3次，1个月后统计枝条上芽的萌发情况，按下式计算萌芽率：

萌芽率=萌发芽个数/扦插枝条芽的总数×100%。

1.2.3 数据分析 采用Excel 2007和SPSS 17.0软件，对试验数据进行预处理及方差分析和相关性分析。

2 结果与分析

2.1 低温胁迫后不同杂交榛品种枝条的电解质渗出率

外渗电导率法是植物抗寒性研究的一种常用方法，电解质渗出率越低，则抗寒性越强；反之电解质渗出率越高，则抗寒性越弱[6,15]。由图1可以看出，榛子枝条经不同低温处理后，电解质渗出率随处理温度的降低而升高，但上升速度并不均匀。处理温度与电解质渗出率之间呈负相关，相关系数为 -0.957～-0.989，达到极显著水平(P<0.01)。在-15～-25 ℃，4个品种的电解质渗出率均逐渐升高；到达 -25 ℃ 时，平顶黄和新榛2号的电解质渗出率较大，分别是对照(CK)的1.27倍和1.21倍，而新榛1号和新榛3号分别是对照的1.17倍和1.14倍；在 -25～-35 ℃，各品种电解质渗出率增幅较大，平顶黄、新榛2号、新榛1号和新榛3号的电解质渗出率增幅分别达39.7%，46.0%，55.1%和53.7%；在-35～-40 ℃，电解质渗出率上升速率变缓，平均增长了4.2%，表明细胞膜组织受损较为严重，渗出的电解质接近饱和量，细胞膜受到不可逆伤害。在不同低温处理下，电解质渗出率变化趋势呈“S”型曲线。

图1 低温胁迫下平欧杂交榛不同品种枝条的电解质渗出率

方差分析结果显示，各品种电解质渗出率平均值在不同低温处理间的差异性达到极显著水平(P<0.01)，经多重比较，其在-25～-35 ℃间差异显著(P<0.05)，此阶段随着温度的降低枝条受侵害程度加重，电解质渗出率急骤上升，说明枝条组织细胞受到的伤害加剧，膜透性增加，细胞内电解质大量外渗。

2.2 低温胁迫后不同杂交榛品种枝条的MDA含量

许多研究认为，植物材料中的MDA含量可以用来评价植物的抗寒性[16]。植物器官衰老或在逆境条件下往往发生膜脂过氧化损伤，导致MDA含量上升。通常将MDA含量作为膜脂过氧化指标，表示细胞膜脂过氧化程度及对逆境反应的强弱，MDA含量高说明植物抗寒性弱，反之则抗寒性强[10]。由图2可以看出，4个杂交榛品种的MDA含量均随温度的降低而升高，处理温度与MDA含量呈负相关，相关系数为-0.889～-0.985，达到显著水平(P<0.05)。在-15～-20 ℃，新榛1号的MDA含量增长幅度较大，为28.2%，之后增幅趋缓，这是因为新棒1号在低温胁迫开始时不适应，应激反应较大，之后随着自身调节的进行，MDA含量增长维持平稳状态；新榛2号在-25～-30 ℃，MDA含量增长较为剧烈，-30 ℃后，基本保持恒定状态，但在处理低温内，新榛2号MDA含量始终最大；在处理低温内，新榛3号MDA含量的增长速率较为均衡，平均增幅31.3%；平顶黄在-15～-25 ℃，MDA含量增长幅度为58%，表明在此温度区间膜脂过氧化反应较剧烈，在-25 ℃后，MDA含量维持恒定状态，并超越新榛1号和新榛3号，仅次于新榛2号。

方差分析结果显示，各品种MDA平均含量在不同低温处理间的差异性达到显著水平(P<0.05)，经多重比较，-15 ℃的MDA平均含量与 -35和-40 ℃间差异显著，在-40 ℃时MDA平均含量达到最大值。由图2可知，在各低温处理下，新榛2号的MDA含量始终高于其余品种，最大值为9.747 μmol/g；平顶黄次之，MDA含量最大值为 8.581 μmol/g；新榛3号和新榛1号较小，MDA含量最大值分别为8.230和7.599 μmol/g。

2.3 低温胁迫后不同杂交榛品种枝条的游离Pro含量

游离Pro是参与植物细胞抗寒的主要渗透调节物质，可以提高细胞液浓度，降低水势，增强保水能力，从而降低冰点，使植物能够忍受一定程度的低温胁迫[17]。游离Pro普遍存在于植物体内, 通常在植物体内的含量并不高，但当植物受到逆境胁迫时，其体内游离Pro含量会迅速增加[16]。游离Pro含量越高，植物的抗寒性越强，反之，则抗寒性越弱。由图3可知，在低温胁迫下，4个杂交榛品种的游离Pro含量随温度的降低而增加，处理温度与游离Pro含量呈负相关，相关系数为-0.956～-0.993，达极显著水平(P<0.01)。在-15～-35 ℃，4个品种游离Pro含量均保持增长状态，-35 ℃时，新榛1号、新榛2号、新榛3号和平顶黄的游离Pro含量分别较对照(CK)增加了28.9%，31.3%，31%和 39.2%；此后，游离Pro含量增长较为平缓，至-40 ℃时平均增长了3.6%。

图2 低温胁迫下平欧杂交榛不同品种枝条的MDA含量

方差分析结果显示，各品种游离Pro平均含量在不同处理低温间的差异性达极显著水平(P<0.01)；经多重比较可知，4个杂交榛品种的游离Pro含量在-25～-35 ℃时均有显著性差异(P<0.05)，此阶段游离Pro含量急剧升高，表明随着温度的降低，植株受到的伤害加剧，其通过提高游离Pro含量进行自我调节，抵御逆境。

2.4 低温胁迫后不同杂交榛品种枝条的POD活性

POD是与膜保护有关的酶，杨向娜等[9]通过研究POD活性与仁用杏抗寒性的关系，确定POD活性可作为仁用杏抗寒性的鉴定指标，用其鉴定仁用杏抗寒性不但简便快捷，而且可靠。由图4可以看出，4个杂交榛品种的POD活性随温度的降低而降低，处理温度与POD活性间呈正相关，相关系数为0.950～0.994，达极显著水平(P<0.01)。在处理低温内，新榛1号、新榛2号、新榛3号和平顶黄的POD活性降低幅度均较大，分别达92.7%，96.7%，97.1%和91.7%。新榛3号在-25 ℃时，POD活性较对照降低了212.2%，下降速率较快，之后降幅较为平缓；其余3个品种在供试温度范围内POD活性均呈缓慢下降态势。

方差分析结果显示，各品种POD活性平均值在不同低温处理间的差异性达极显著水平(P<0.01)，经多重比较，其在-15～-25 ℃间差异显著(P<0.05)，此阶段POD活性下降速度较快，表明受低温侵害时，POD对低温较为敏感，在初期就出现剧烈反应。

图4 低温胁迫下平欧杂交榛不同品种枝条的POD活性

2.5 低温胁迫对不同杂交榛品种萌芽率的影响

树体受冻后能否存活，关键在于枝条能否恢复发芽能力。因此，经人工模拟低温处理后，枝条恢复发芽的能力可以客观反映出不同品种的实际抗寒水平[18]。由表1可知，随着温度的降低，4个杂交榛品种枝条的萌芽率逐渐降低，处理温度与萌芽率呈正相关，相关系数0.933～0.978，达到极显著水平(P<0.01)。由方差分析结果可知，不同低温处理间各品种的平均萌芽率差异达显著水平(P<0.05)。低温处理时4个品种的萌芽率均低于对照(-15 ℃)，且差异显著(P<0.05)；-20～-35 ℃，萌芽率缓慢下降，且-35 ℃时的萌芽率显著低于-20，-25和-30 ℃(P<0.05)；随着温度的进一步降低，-40 ℃时的萌芽率显著低于其他低温处理(P<0.05)。由试验结果可知，低温对杂交榛的枝条萌发可产生一定影响，当-35 ℃持续24 h，供试的4个品种的枝条萌芽率在35%～60%；当-40 ℃持续24 h，新榛1号和新榛3号仅有1/3的枝条能够萌发，新榛2号和平顶黄的萌芽率仅有13%。在处理低温内，平顶黄的萌芽率始终最低。

表1 低温胁迫下4个平欧杂交榛品种的枝条萌芽率

2.6 低温胁迫下不同杂交榛品种枝条各生理指标间的相关性

对4个杂交榛品种在不同低温诱导下的MDA含量、游离Pro含量、POD活性、萌芽率与电解质渗出率的相关性进行分析，结果见表2。

表2 低温胁迫下不同平欧杂交榛品种枝条的5个生理指标间的相关性分析

表2表明，MDA含量、游离Pro含量与电解质渗出率呈极显著正相关，相关系数分别为0.681和0.826；POD活性、萌芽率与电解质渗出率呈极显著负相关，相关系数分别为-0.889和-0.879。MDA含量与游离Pro含量呈显著正相关，相关系数为0.428；与POD活性和萌芽率呈极显著负相关，相关系数分别为-0.800和-0.687。游离Pro含量与POD活性和萌芽率呈极显著负相关，相关系数分别为-0.686和-0.697。POD活性与萌芽率呈极显著正相关，相关系数为 -0.878。

3 讨 论

植物的抗寒性机制较为复杂，衡量一个品种的抗寒性不能单纯用1～2个指标，而应用多个指标进行综合评估[19]。Lyons[20]认为，植物受到低温影响时，细胞质膜透性增加的程度较大，电解质会有不同程度的外渗，以致电导率加大，抗寒性较强的细胞或受害轻者不仅渗透性增大的程度较小，而且渗透性的变化可以逆转，易于恢复正常；反之，抗寒性弱的细胞或受害重者不能恢复正常，以致造成伤害甚至死亡，这种变化明显地出现在外部形态变化之前。电导法就是依据以上原理来鉴定植物抗寒性的强弱，电解质渗出率是评价植物抗寒性的主要生理指标。

在低温逆境下，可以通过MDA含量、游离Pro含量和POD活性的大小来判断某一植物抗寒性的强弱，也可以通过观察萌芽率来判断植株的抗寒能力。本研究由相关性分析可知，电解质渗出率与以上4个指标呈极显著相关，说明这些指标均可作为评价杂交榛抗寒性的生理指标。

MDA是植物受低温冻害后膜脂过氧化的产物，对细胞有一定的毒害作用，随着温度的降低，细胞伤害加剧，当膜脂过氧化达到不可逆程度时，MDA含量增加缓慢[21]，维持平稳状态；游离Pro可以调节细胞渗透压，防止细胞过度脱水[22]，保护植物不受或少受伤害。本研究表明，低温胁迫后4个杂交榛品种的电解质渗出率、MDA和游离Pro含量均表现为随温度降低而增加的趋势，且4个品种的变化规律较为明显，新榛1号的电解质渗出率和MDA含量始终最小，可知其抗寒性相对较强；新榛1号和新榛3号的游离Pro含量相对较大，表明其适应低温逆境的能力优于其余2个品种。当植物受到低温胁迫时，体内自由基大量积累，毒害植物细胞，而POD通过酶促降解H2O2来避免自由基对细胞膜的过氧化伤害和防止其他伤害[23]，以保护植株细胞具有活力。本研究表明，低温胁迫后4个品种杂交榛的POD活性和萌芽率均随温度的降低而降低，在-15～-40 ℃，新榛1号的POD活性和萌芽率始终最大，新榛3号次之，表明其对低温的忍耐力相对较强。

本研究发现，平顶黄和新榛2号的MDA、游离Pro含量和POD活性较为接近，但平顶黄的电解质渗出率大于新榛2号，且萌芽率也远低于后者。由此可知，平顶黄的抗寒性相对弱于新榛2号。综合以上结果得知，4个品种杂交榛的抗寒力强弱顺序为：新榛1 号>新榛3号>新榛2号>平顶黄。

4 结 论

4个平欧杂交榛品种经24 h不同低温处理后，其电解质渗出率、游离Pro含量与处理温度呈极显著负相关，MDA含量与处理温度呈显著负相关，POD活性、萌芽率与处理温度呈极显著正相关；电解质渗出率、游离Pro含量、POD活性和萌芽率在各低温处理间的差异性达极显著水平，MDA含量在各低温处理间的差异性呈显著水平；MDA含量、游离Pro含量与电解质渗出率呈极显著正相关，POD活性、萌芽率与电解质渗出率呈极显著负相关。

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