慢病毒活体介导精原干细胞生产转基因小鼠

辛 颖,张 涛,2,张优优,张智英

(1 西北农林科技大学 动物科技学院，陕西 杨凌 712100；2 陕西理工学院 生物科学与工程学院，陕西 汉中 723001)

自1980年第一只转基因小鼠[1]问世以来，科学家们便能够在体内选择性地修饰一个基因，来进行复杂的基因组精确操作，这对基础遗传学和应用遗传学来说是一个意义重大的跨越。转基因动物生产技术经过20多年发展，极大地促进了基础生命科学、医学及动物育种的快速发展。传统的转基因动物生产技术是把外源基因注射到一个单细胞的胚胎，然后将胚胎移植到假孕的母体，但由于实验花费昂贵，费力费时，并且需要数个雌性供体，这严重限制了转基因动物的发展。近年来，有报道通过慢病毒感染体外分离的小鼠精原干细胞，再筛选感染成功的精原干细胞，将其注射到经过处理的不育小鼠睾丸内，以此生产转基因动物，此项技术不涉及体外显微操作和胚胎移植，发展非常迅速。

慢病毒属于逆转录病毒科，不但可以感染分裂期细胞，还能感染静止期细胞，并且能把携带的外源基因整合到宿主基因组内进行长期、稳定、高效表达，不易诱发宿主免疫反应，安全性较好[2-3]。目前，广泛应用的慢病毒载体系统多是以HIV-1为基本骨架的3载体系统，该系统删除了致病基因和长末端重复序列(Long terminal repeat，LTR)上的U3，造成慢病毒大部分基因转录失活，基因组复制受到限制，从而使其安全性显著提高[4-5]。精原干细胞(Spermatogonial stem cells，SSCs)是睾丸内能够自我更新，具有生精能力并能将遗传信息传递给子代的一类细胞，是对生殖细胞系进行修饰的适当靶点。对精原干细胞进行的基因修饰是可遗传的，通过受精即可传递给后代，获得整合位点不同的转基因动物[6-7]。慢病毒感染精原干细胞生产转基因动物的方法主要是用慢病毒感染体外培养的精原干细胞，然后将精原干细胞移植到受体动物睾丸内，使受体能够产生转基因精子，进而通过各种途径获得转基因后代[8]。Hamra等[9]用携带绿色荧光蛋白(EGFP)基因的慢病毒载体感染大鼠精原干细胞，在其后代中有30%携带有外源基因。但是由于对不同物种的精原干细胞自身增殖和分化的机制还不清楚，精原干细胞的分离纯化、长期培养和移植等技术也不成熟，不能在很多实验室进行，这严重限制了该技术的广泛推广。

本研究把携带有EGFP基因的慢病毒注射到小鼠睾丸曲细精管中，通过慢病毒感染睾丸未分化的精原细胞，在活体上把EGFP基因转移到小鼠精原干细胞中，然后进行自然交配，获得携带有EGFP的转基因后代，以建立一个操作简单、花费少且高效的慢病毒介导的在活体上修饰精原干细胞生产转基因动物的技术平台。

1 材料与方法

1.1 试验动物

试验动物为雄性昆明小白鼠，购自第四军医大学实验动物中心，实验室长期饲养繁殖。

1.2 试剂与设备

慢病毒载体系统由pLL3.7载体、pSPAX2载体和pMD2.G载体3质粒组成，由西北农林科技大学动物医学院华进联教授惠赠。质粒抽提试剂盒购自AXYGEN 生物技术有限公司，明胶、青霉素、链霉素、TritonX-100 等购自Sigma公司；大肠杆菌JM109、DH5α感受态菌种和293T细胞均为西北农林科技大学动物基因组学实验室保存；Lipofectamine 2000、DMEM-高糖培养基和胰蛋白酶购自Invitrogen公司，优级胎牛血清购自Hyclone；TaqDNA 聚合酶、DNA Marker购自北京全式金生物科技有限公司。PCR引物由上海博尚生物技术有限分司合成。GFP抗体购自碧云天生物科技有限公司，PLZF一抗选用羊源PLZF抗体，购自美国SANTA，PLZF二抗为Alexa Fluor®488 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Antibody，购自Life technology公司。

1.3 慢病毒的制备

将293T细胞于转染前24 h以105mL-1的密度接种于10 cm 细胞培养皿中，37 ℃、体积分数5% CO2培养箱内培养，待细胞融合度达70%～80%时用于转染。转染前2 h，将293T细胞培养基更换为无血清培养基。取pLL3.7 载体10 μg、pSPAX2 载体7.5 μg，pMD2.G 载体4.5 μg，加入Opti-MEM 溶液，使得混合溶液的总体积为1 mL，将混合溶液在室温下温育5 min。取40 μL Lipofectamine 2000试剂在另一管中与0.9 mL Opti-MEM 混合，在室温下温育5 min。把稀释的混合载体与稀释的Lipofectamine 2000混合，轻轻颠倒混匀，在室温下温育20 min后移至293T细胞培养液中，于37 ℃、体积分数5% CO2细胞培养箱中培养， 8 h后倒掉含转染混和物的培养基，用PBS液清洗，每瓶细胞中加入含体积分数10%胎牛血清的培养基8 mL，于37 ℃、体积分数5% CO2培养箱内继续培养。为减少慢病毒包装过程中需通过超速、长时间离心浓缩才能获得高滴度病毒的繁琐过程，在转染20 h时弃掉培养液，消化下293T细胞，50g离心5 min，沉淀用少量PBS溶液重悬，在液氮和37 ℃水浴锅中反复冻融3 次以裂解细胞释放病毒，试验中应尽可能减少PBS裂解液的体积，以获得高滴度的慢病毒。采用孔稀释法测定慢病毒滴度。

1.4 慢病毒的注射和转基因鼠产生

取出生21 d的雄性小鼠，腹膜内注射速眠新(0.019 mL/g) 麻醉后剃除小鼠腹股沟部毛发，将外科手术部位用酒精清洗干净。于小鼠阴茎前，用灭菌外科剪刀在无菌条件下于腹正中线剪开长度大约为1～1.5 cm的皮肤切口，钝性分开肌肉和腹膜，用灭菌的弯曲镊子轻轻地拉与睾丸相连的背部脂肪，缓缓把睾丸通过切口从阴囊中拨出，将10 μL含有台盼蓝的慢病毒溶液用一个30规格的针头慢慢注射到睾丸曲细精管中，缝合创口，建立F0代小鼠。手术过程中，为了避免小鼠体温下降，将其放在加热板上直到苏醒。取注射后5 d小鼠1只，脱颈处死，迅速取睾丸组织，剥开睾丸外浆膜白膜，释放曲细精管，取部分曲细精管制作冰冻切片。在荧光体视镜和荧光显微镜下观察曲细精管及其冰冻切片，初步判定慢病毒能否在活体上感染小鼠精原干细胞。

1.5 精原干细胞的免疫双荧光检测

另取1只注射后5 d的小鼠和1只同日龄正常小鼠(对照)，脱颈处死，取其睾丸组织，观察2组睾丸组织形态。用PBS溶液清洗试验组睾丸若干次，用苦味酸固定过夜，次日用PBS清洗3～4次，然后用体积分数70%酒精清洗3 次，组织切成适宜大小，按照常规方法制备5 μm厚的石蜡切片，通过免疫双荧光染色检测精原干细胞是否被慢病毒感染。免疫双荧光染色时，用特异抗体PLZF识别睾丸精原干细胞，二抗携带的绿色荧光会将精原干细胞染成绿色。细胞被慢病毒感染后会表达EGFP蛋白，免疫双荧光染色时，EGFP的二抗携带有红色荧光，会将表达EGFP蛋白的细胞染成红色。免疫双荧光染色流程为：切片脱蜡→体积分数0.5%的Tritonx-100室温孵育→抗原修复→血清封闭→羊源PLZF一抗孵育→驴抗羊二抗孵育→PLZF显色→体积分数80%甘油缓冲液封片→荧光显微镜观察。

1.6 转基因小鼠的PCR鉴定

将注射后35 d的雄性小鼠与野生型母鼠按1∶1比例共同饲养进行交配，获得F1代转基因小鼠。剪取F1代小鼠尾部长约0.5 cm的组织，按照《分子克隆试验指南》[10]采用SDS法提取其基因组DNA。以小鼠基因组DNA为模板，用引物F:5′-TGGTTCTGGCGGAATCACCA-3′，R:5′-ACAATCTCCACTTTGCCACTG-3′扩增内参基因GAPDH，以确定基因组的提取效果。

在确定提取基因组质量良好后，用Primer 5.0软件设计慢病毒pLL3.7载体引物，用于PCR检测转基因的效率，引物序列为：F：5′-GGTGTTGTCG-GGGAAATCATC-3′；R：5′-ACACAACAGACGG-GCACACAC-3′。

PCR反应总体系为25 μL：10×PCR缓冲液(含Mg2+)2.5 μL，dNTP(25 pmol/μL)2.0 μL，上、下游引物(10 mmol/L)各1 μL，TaqDNA聚合酶(5 U/μL)0.2 μL，DNA模板(50 ng/μL)1.0 μL，超纯水17.3 μL。PCR反应程序:94 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,33个循环;72 ℃延伸10 min，12 ℃保存。试验同时设以质粒pLL3.7载体作模板的阳性对照(CK1)，以野生型小鼠的基因组DNA作模板的阴性对照(CK2)和超纯水空白对照(CK3)。

2 结果与分析

2.1 慢病毒包装效果的检测

用Lipofectamine 2000试剂共转染3质粒至293T包装细胞，转染20 h后在荧光显微镜下观察，细胞状态良好，并有大量细胞表达绿色荧光，初步判定转染效率在70%左右。通过孔稀释法测定获得的慢病毒滴度，结果在10 倍稀释时，可见大量绿色荧光表达(图1)，转染效率>80%，经计算本试验获得的慢病毒滴度为106TU/mL，能够达到在活体上注射睾丸，感染精原干细胞的要求。

图1 10倍稀释携带有EGFP基因慢病毒感染的293T细胞(×400)

2.2 睾丸曲细精管及其冰冻切片的观察

通过慢病毒注射雄性小鼠睾丸组织，建立F0代小鼠10只，全部成活且生长良好。

将注射5 d后的曲细精管及其冰冻切片放置在荧光显微镜下观察，结果发现曲细精管内壁及其冰冻切片有绿色荧光分布(图2)。精原干细胞一般位于曲细精管内壁的基底部，通过观察发现曲细精管内壁基底部有绿色荧光均匀分布，因此，可初步判定慢病毒在活体上可以感染睾丸组织中的细胞，但感染的细胞是否是精原干细胞，还需要通过免疫双荧光分析来证实。

图2 携带有EGFP基因的慢病毒感染小鼠曲细精管(A)及其冰冻切片(B)的观察(×100)

2.3 小鼠睾丸组织的免疫双荧光检测

制作小鼠睾丸组织石蜡切片，观察发现注射慢病毒后小鼠睾丸发育正常，形态上与正常小鼠睾丸组织相比没有异常变化。PLZF可特异性地标记精原干细胞，其二抗携带绿色荧光，从图3-A可见，在曲细精管基底部的细胞发出了绿色荧光，确认为精原干细胞。试验中被慢病毒感染的细胞表达EGFP蛋白，标记表达EGFP蛋白的二抗携带红色荧光，睾丸组织切片中发现了红色荧光标记的细胞(图3-B)，表明该细胞被慢病毒感染。为了确认表达EGFP的细胞为小鼠精原干细胞，把2张切片重叠，发现绿色荧光标记与红色荧光标记在同一细胞上(图3-C)，表明小鼠睾丸中的精原干细胞可被慢病毒感染。因此，可以确定慢病毒能够在活体上感染精原干细胞，且效率较高。

图3 注射携带有EGFP基因慢病毒后小鼠睾丸组织的免疫双荧光染色观察(×400)

2.4 转基因小鼠的鉴定

将8 只F0代小鼠分为A、B、C、D、E、F、G、H 8组，注射35 d后分别与野生型母鼠按照1∶1比列交配，其中6 只母鼠受孕，共生产F1代小鼠41 只(表1)。内参基因GAPDHPCR扩增结果(图4)表明，本试验F1代小鼠基因组提取质量和PCR条件良好，可以用于慢病毒基因组PCR检测。PCR检测结果表明，41只F1代小鼠中有21只扩增出约 1 000 bp的慢病毒基因组片段(图4)，转基因的效率为 51.22% (表1)。由图4可知，不同F1代小鼠个体之间慢病毒基因组PCR产物的含量不同，由于PCR检测时，模板量统一为50 ng/μL，且不同个体间GAPDH的扩增量一致(图5)，因此可初步判断在不同F1个体之间，慢病毒携带的外源基因整合在基因组中的位点数和效率是不同的。

表1 慢病毒注射建立的F0代小鼠后代转基因效率检测

图4 F1代转基因小鼠携带慢病毒pLL3.7载体的PCR检测(部分结果)

图5 F1代转基因小鼠GAPDH基因的PCR扩增(部分结果)

3 讨 论

精原干细胞是形成雄性生殖细胞的前体,不但能自我更新生成新的干细胞,还可不断增殖分化形成各阶段的生殖细胞和精子，对后代遗传起着决定性的作用[11-12]。Nagano等[13]用重组反转录病毒体外感染精原干细胞，然后通过异种移植技术把感染细胞移植到雄性鼠睾丸中，从而获得转基因小鼠，但生产转基因小鼠的成功率较低，且精原干细胞分离纯化、培养都非常困难，难于操作。Hamra等[14]用慢病毒进行与Nagano同样的实验，借助慢病毒高效感染的特点，转基因小鼠生产的成功率有较大提高。Pfeifer等[14]用重组的慢病毒感染受精卵，然后把胚胎移植到假孕的母体，该方法大大提高了转基因的成功率，但过程繁琐并需要大量雌性供体。Dhup等[15]报道通过电击法将DNA导入成年鼠的睾丸，电击处理的17 只鼠有16 只能够生产转基因后代。

基于前人的研究成果，本研究构建了一种操作简单、花费少并且能有效地生产转基因鼠的技术平台，主要是把携带EGFP基因的慢病毒注射到小鼠曲细精管，在活体上通过慢病毒感染精原干细胞，并把期望的外源基因整合到精原干细胞的基因组中，然后通过自然交配即可获得转基因动物。Hamra等[9]用慢病毒感染雄性小鼠生殖细胞，移植到野生型小鼠的睾丸组织，发现3 只雄性鼠中只有1只具有繁殖能力。本研究用建立的8 只F0代雄性小鼠进行交配试验，结果有6 只产生了F1代， F0代的繁殖能力为75%。通过对每组产生的F1代小鼠进行转基因效率检测发现，转基因效率最低为0，最高为100%，平均为51.22%。该技术体系用构建的慢病毒载体在活体上对精原干细胞进行操作，从而生产转基因动物，结果表明，该方法对动物的遗传与发育影响很小，且慢病毒介导的转基因能在生殖细胞系中遗传，这与预期的结果一致。另外，采用此技术可以整合不同的基因生产多种转基因后代，建立多种转基因品系。本试验要求把慢病毒注射到小鼠曲细精管，使病毒易于感染精原干细胞，但在不损伤睾丸组织的前提下，精准注射到曲细精管是非常困难的。因此分析认为，造成本试验中F0代部分小鼠繁殖能力受损和不同个体产生转基因后代效率差异较大的原因可能是，注射病毒时操作损伤、不能精准注射到曲细精管同等剂量的病毒及慢病毒感染和整合效率不同等。

尽管本试验生产转基因动物的效率不如传统的慢病毒转基因方法，但该技术花费少，操作简单，快捷且易于实施，对小鼠的生育能力危害小，使转移的基因在生殖细胞中传递，且需要的动物数量很少，F0代小鼠能交配多次，可以生产大量的转基因后代，生产成本大大降低。另外，该技术体系也可以应用到其他动物，这将会促进生殖医学、畜牧业遗传育种和基因功能研究等领域的快速发展。

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