5株产ACC脱氨酶细菌的筛选与鉴定

张国壮，李海超，孙永林，刘西平

(西北农林科技大学 生命科学学院，陕西 杨凌 712100)

区域性干旱、季节性干旱以及全球气候变化引发的极端干旱天气等常常导致大面积的作物产量降低，而旱地农业在我国及世界粮食生产中占据着相当大的比重。因而，促进作物在干旱条件下的生长对于提高和稳定粮食产量、满足不断增长的粮食需求具有重要的意义。然而，当土壤水分匮乏时，施肥这一作为近百年来提高和维持粮食产量的重要措施，却难以取得理想的效果，而且化肥的大量使用会引起水体和土壤污染、土壤板结等一系列环境问题。因此，利用植物自身的代谢特点，通过生物学措施提高逆境条件下作物的产量就显得尤为重要。

在干旱胁迫下，植物根系的乙烯代谢明显增强[1]，而乙烯含量的异常增加会抑制植物生长，加快叶片成熟、衰老和死亡，降低叶片光合作用，从而降低作物产量，并且会阻碍植株在胁迫因子消除后的复原[2-4]。研究表明，在植物根际存在有能产生1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)脱氨酶的细菌，这类细菌可以吸收、分解植物根系分泌出的ACC，并利用其分解产物α-丁酮酸和氨分别作为C源和N源，使根际的ACC浓度降低，进而促使根系不断的向外分泌ACC[3,5-6]，从而降低根系中ACC和应激乙烯的水平，减轻逆境下乙烯对植物的伤害，促进植物的生长发育[7-8]，提高作物产量[9]。并且，这些根际细菌往往能产生3-吲哚乙酸(IAA)和铁载体，并能溶解土壤无机磷等，直接或间接地促进植物生长发育、提高其抗逆能力[7,10]。但到目前为止，我国在旱地小麦上对这一领域开展的研究工作并不多[11]。本研究以ACC为唯一氮源，采用富集筛选法从旱地小麦根际土壤中筛选出5株产ACC脱氨酶的菌株，并对其生理生化特性及潜在的促生能力进行研究，以期为该类根际促生菌在农业上的应用奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 试 剂 Salkowski试剂：1 mL 0.5 mol/L FeCl3溶液与50 mL体积分数 35%的高氯酸溶液混合。10×MM9溶液：Na2HPO460 g/L，KH2PO41.5 g/L，NaCl 2.5 g/L，NH4Cl 5 g/L。

1.1.2 培养基 PAF(Pseudomonas agar F)培养基：每升培养基中含酪蛋白水解物 10 g、蛋白胨 10 g、无水MgSO41.5 g、K2HPO41.5 g、甘油 10 mL，pH 7.2。

DF盐培养基[12]：每升培养基中含Na2HPO46.0 g、KH2PO44.0 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、葡萄糖 2.0 g、葡萄糖酸 2.0 g、柠檬酸 2.0 g、(NH4)2SO42.0 g、FeSO4·7H2O 1 mg、H3BO310 μg、MnSO4·H2O 11.19 μg、ZnSO4·7H2O 124.6 μg、CuSO4·5H2O 78.22 μg、MnO310 μg，pH 7.2。

DFa液体培养基：将配制的0.5 mol/L ACC(购自美国Sigma公司)溶液通过0.2 μm的膜抽滤除菌后，将ACC以终浓度为3.0 mmol/L 加入到不含(NH4)2SO4的DF盐培养基中。

DFa固体培养基：每升DFa液体培养基中加入琼脂15～20 g。

TSB液体培养基：每升培养基中含大豆胨 3 g、胰蛋白胨 17 g、NaCl 5 g、葡萄糖 2.5 g、K2HPO42.5 g，pH 7.1～7.5。

TSB固体培养基：每升TSB液体培养基中加入琼脂15～20 g。

PKO培养基：每升培养基中含NaCl 0.3 g、MgSO4·7H2O 0.3 g、MnSO4·4H2O 0.03 g、KCl 0.3 g、(NH4)2SO40.5 g、FeSO4·7H2O 0.03 g、葡萄糖10 g、Ca3(PO4)25 g、琼脂15～20 g，pH 7.0～7.5；其中Ca3(PO4)2需磨细、过筛并单独灭菌后与培养基混合。

LB(Lysogeny broth)培养基：每升培养基中含胰蛋白胨 10 g、酵母提取物 5 g、NaCl 10 g、琼脂18 g，pH 7.0～7.4。

1.2 方 法

1.2.1 产ACC脱氨酶菌株的富集、筛选和分离纯化 挖出旱地小麦根系，将根系表面粘着的土壤抖下，即得根际土。取1 g根际土壤加入到50 mL灭菌的PAF液体培养基中，28 ℃、200 r/min条件下振荡培养24 h；取1 mL 菌悬液重复振荡培养1次，以富集细菌。吸取第2次培养液1 mL加入到 50 mL灭菌的DF盐培养基中，在28 ℃、200 r/min条件下振荡培养24 h并转接一次，吸取上述菌悬液1 mL转移至 50 mL含3.0 mmol/L ACC的DFa液体培养基中，在28 ℃、200 r/min条件下筛选培养24 h。重复转接3次后，将梯度稀释的菌悬液涂布于DFa固体培养基平板上进行分离纯化，28 ℃恒温培养，待长出单菌后，挑取单菌落保存至TSB固体培养基的斜面上，并以含体积分数30%甘油的混悬液形式保存于―80 ℃冰箱中[13]。

1.2.2 分离菌株的ACC脱氨酶活性测定 ACC脱氨酶活性的测定按照Penrose等[13]的方法进行。将筛选的菌株接种至20 mL TSB液体培养基中，在28 ℃、200 r/min条件下振荡培养12 h，之后于4 ℃、8 000 r/min 离心10 min，收集菌体沉淀。将菌体重新悬浮在7.5 mL 无氮源的DF培养基中，并加入45 μL 经过滤灭菌的0.5 mol/L ACC溶液，使ACC终浓度为3.0 mmol/L，然后在28 ℃、200 r/min 条件下振荡培养24 h以诱导细菌的ACC脱氨酶活性。将上述菌悬液在4 ℃、8 000 r/min 离心10 min，去除上清液，收集菌体沉淀，重新悬浮于5 mL 0.1 mol/L Tris-HCl缓冲液(pH 7.6)中，再4 ℃、8 000 r/min 离心10 min 后收集沉淀，该步骤重复3次以彻底去除DF培养基。向菌体沉淀中加入1 mL 0.1 mol/L Tris-HCl(pH 7.6)以悬浮菌体，然后转移至1.5 mL离心管中，16 000 r/min 下离心5 min；之后将菌体沉淀再次悬浮于600 μL 0.1 mol/L Tris-HCl缓冲液(pH 8.5)中，加入30 μL甲苯，漩涡振荡30 s 以破碎菌体。吸取200 μL破碎细胞菌悬液，加入20 μL 0.5 mol/L ACC溶液，混匀后于30 ℃条件下水浴15 min。然后向其中加入1 mL 0.56 mol/L HCl混匀，室温下16 000 r/min离心5 min。取上述离心上清液1 mL，加入800 μL 0.56 mol/L HCl，混匀后再加入300 μL 2,4-二硝基苯肼(使用2 mol/L HCl溶解，质量浓度为2 g/L)，30 ℃下水浴 30 min。然后，加入2 mL 2 mol/L NaOH显色，用紫外可见分光光度计(U-2900，日本Hitachi公司)在540 nm下测定其吸光值(OD540)，以蒸馏水代替菌悬液的处理作为对照。

用0.1 mol/L Tris-HCl缓冲液(pH 8.5)配制0.2，0.4，0.6，0.8和1.0 mmol/L 的标准α-丁酮酸梯度溶液，并向其中分别加入300 μL的2,4-二硝基苯肼(使用2 mol/L HCl溶解，质量浓度为2 g/L)，混匀后于30 ℃下水浴30 min。然后加入2 mL 2 mol/L NaOH显色，稳定后测定其OD540，以Tris-HCl(pH 8.5)溶液做空白对照。按照α-丁酮酸溶液浓度及其对应的吸光值制作标准曲线，求其回归方程。

将样品的OD540代入标准曲线回归方程得到其中α-丁酮酸的含量，计算每min ACC脱氨酶催化ACC生成α-丁酮酸的物质的量(μmol)，即为1个单位酶活力(U)。利用考马斯亮蓝G-250法[14]，测定剩余菌悬浮液中的蛋白质含量，以牛血清蛋白(BSA，国药集团生产)为对照。用单位酶活力除以总蛋白质量即为比活力(U/mg)，以此表示细菌的ACC脱氨酶活性。

1.2.3 筛选菌株的鉴定 (1)细菌形态特征观察。用革兰氏染色法对筛选所获菌株染色后，在显微镜下观察细菌形态特征，并在牛肉膏蛋白胨培养基平板上划线培养2 d(培养温度28 ℃)，观察各菌株菌落形态。

(2)细菌生理生化特征测定。根据细菌营养特征和形态特征，参照《常见细菌系统鉴定手册》[15]对筛选的菌株进行生理生化特征鉴定。

(3)16S rDNA序列测定与系统发育分析。使用离心柱型细菌基因组DNA提取试剂盒(购自北京三博远志试剂有限公司)提取筛选所获菌株的总DNA。参照Watanabe等[16]的方法，以细菌总DNA为模板，采用正向引物27f：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′(在E.coli16S rDNA中对应位置为8-27 bp)和反向引物1522r：5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′(在E.coli16S rDNA中对应位置为1 541-1 522 bp)，进行16S rDNA扩增，引物由上海生工生物有限公司合成。PCR反应体系(50 μL)如下：Taqmix(购自日本TaKaRa公司)25 μL，ddH2O 21 μL，正向引物1 μL，反向引物1 μL，模板DNA 2 μL。 PCR反应条件如下：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，51 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，30个循环；72 ℃延伸10 min。然后，利用10 g/L琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测，将目的片段切下用胶回收试剂盒(购自日本TaKaRa公司)进行纯化后，克隆至pGEM-18T Easy载体，转化E.coliJM109感受态细胞，使用含100 μg/mL氨苄青霉素的LB(Lysogeny broth)平板筛选阳性克隆，并将阳性克隆送至上海美吉生物医药科技有限公司进行测序。将所得序列与GenBank数据库中的序列进行Blast分析，选取与筛选菌株16S rDNA序列同源性较高的模式菌株序列，用CluxalX 2.0软件进行多重序列比对分析，利用Mega 4.0软件中的邻接法构建系统发育树。

1.2.4 分离菌株的促生潜力测定 (1)产生IAA能力测定。参照Loper等[17]的方法，将分离所获菌株分别接种在含色氨酸(100 mg/L)的TSB液体培养基中，28 ℃、200 r/min条件下振荡培养48 h 后 8 000 r/min 离心10 min。取上述离心后的上清液2 mL，加入50 μL体积分数83%的正磷酸和4 mL Salkowski试剂，溶液变为粉红色即表示有IAA产生。菌株产生IAA的浓度采用比色法测定，以含色氨酸的无菌TSB培养基为对照，测定菌株反应液在530 nm下的吸光值(OD530)。配置10，20，30，40和50 mg/L 的标准IAA梯度溶液，按上述条件进行反应后测定反应液的OD530，制作标准曲线并求其回归方程。将各菌株样品的OD530代入回归方程，计算各细菌培养液中的IAA浓度。每组试验重复3次。

(2)产生铁载体能力测定。参照王平等[18]的方法进行测定。取10 mL 1.98 mmol/L 的铬天青溶液与2 mL 1 mmol/L FeCl3混匀，缓缓加入到8 mL 5.14 mmol/L 的CTAB(Hexadecyl trimethyl ammonium Bromide)溶液中，得到染色剂。将20 mL 10×MM9溶液和6.04 g 哌嗪二乙醇磺酸加入到150 mL ddH2O中，用500 g/L NaOH调节pH至6.8，再加入3.2 g 琼脂粉，得到培养基。将分别灭菌的0.2 mL 1 mmol/L CaCl2，4 mL 1 mmol/L MgSO4·7H2O，2 mL 200 g/L葡萄糖，6 mL 100 g/L酪蛋白氨基酸加入到培养基中，再将灭菌好的染色剂沿瓶壁加入培养基中，摇匀后倒入培养皿中，每皿30 mL。用接种环从保存的各菌株斜面上挑取菌苔于上述平板上划线接种，置于28 ℃培养，3 d 后观察培养基上菌落周围橙黄色晕圈的有无，以此来比较各菌株产生铁载体能力的强弱。

(3)溶磷能力测定。采用Verma等[19]的方法测定。将筛选的菌株分别点接于PKO培养基平板上，每个菌株接4皿，每皿点接4个重复，28 ℃下培养10 d 后，观测其透明溶磷圈的有无及其大小，根据溶磷圈直径与菌落直径的比值衡量各菌株的溶磷能力大小。

2 结果与分析

2.1 产ACC脱氨酶菌株的筛选及其ACC脱氨酶活性

经定向富集、筛选和分离后，从旱地小麦根际土壤中共获得了5株产ACC脱氨酶的细菌菌株，将其分别命名为BL、CL1、CL2、DL和DS。以α-丁酮酸标准液的浓度为纵坐标(y)，OD540为横坐标(x)绘制标准曲线，得到回归方程为：y=2.398 8x-0.000 9(R2=0.997 5)。测得菌株BL、CL1、CL2、DL和DS菌悬液的OD540分别为0.232，0.199，0.094，0.143和0.018；蛋白质质量浓度分别为265.7，98.9，44.2，59.9和29.0 mg/mL，根据标准曲线及蛋白质含量即可得到各菌株的ACC酶活性，结果见图1。由图1可知，从分离获得的5个菌株破碎细胞悬浮液中均检测到具有活性的ACC脱氨酶，但其活性表现出显著差异，其中，DL菌株产生的ACC脱氨酶活性(0.077 U/mg)最高，而DS菌株的最低(0.018 U/mg)；菌株CL1(0.065 U/mg)、CL2(0.068 U/mg)和DL的ACC脱氨酶活性显著高于BL(0.028 U/mg)和DS菌株(图1)。

图1 筛选菌株的ACC脱氨酶活性

2.2 产ACC脱氨酶菌株的鉴定

2.2.1 形态学特征 革兰氏染色与镜检结果表明，筛选的5个菌株都为革兰氏阴性杆菌，在牛肉膏蛋白胨培养基上培养2 d后观察发现，筛选的5个菌株的菌落均为圆形且边缘光滑(图2)，其中BL的菌落直径为0.9～1.0 mm，边缘光滑，呈白色；CL1菌落直径为1.3～1.5 mm，菌落中心略突起，呈乳白色；CL2菌落直径约1.3 mm，呈白色；DL菌落直径约0.9 mm，呈白色；DS菌落直径约1 mm，边缘较薄，呈浅黄色至黄色。

2.2.2 生理生化特征 表1显示，菌株BL、CL1、CL2和DL甲基红测试均呈阴性，其中CL1鸟氨酸脱羧酶阴性，证明CL1应为克雷伯氏菌属，而其他3株菌都属于肠杆菌属；DS甲基红测试呈阳性，能产生黄色素且能利用纤维二糖，初步判断DS属于勒克氏菌属。根据生理生化鉴定结果，参照《常见细菌系统鉴定手册》[15]中关于细菌种的形态和生理生化特征描述，将5株细菌初步鉴定为：BL.阿氏肠杆菌(Enterobacterasburiae)，CL1.肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)，CL2.路德维希肠杆菌(Enterobacterludwigii)，DL.阿氏肠杆菌，DS.非脱羧勒克氏菌(Leclerciaadecarboxylata)。

图2 5株产ACC脱氨酶细菌的菌落形态

表1 5株产ACC脱氨酶细菌的主要生理生化特征

2.2.3 系统发育分析 从构建的系统发育树(图3)可以看出，BL、CL2、DL都聚在一个分支内，并且与肠杆菌属(Enterobacter)聚在一簇，这说明上述3种菌株都应属于肠杆菌属；而CL1和肺炎克雷伯菌聚在同一分支，DS和非脱羧勒克氏菌聚在同一分支，证明CL1和DS应分属于克雷伯氏菌属和勒克氏菌属。

根据生理生化测定结果和16S rDNA系统发育分析及序列同源性比对结果(表2)，可将5个菌株鉴定为：BL和DL均为阿氏肠杆菌(Enterobacterasburiae)，但可能属于不同的表型；CL1为肺炎克雷伯氏菌；CL2为路德维希肠杆菌；DS为非脱羧勒克氏菌。

2.3 分离菌株的促生潜力

2.3.1 产生IAA的能力 以标准IAA溶液的质量浓度为纵坐标(y)，OD530为横坐标(x),绘制标准曲线，得到回归方程为y=152.75x-1.884 64(R2=0.995 1)。测得菌株BL、CL1、CL2、DL和DS反应液的OD530分别为0.053，0.157，0.124，0.089和0.224，根据IAA标准曲线计算出各菌株产IAA能力，结果见图4。图4显示，筛选的5个菌株均具有产生IAA的能力，但产生的IAA质量浓度差异显著，其中DS产生IAA的能力显著高于其他菌株。结合图1结果可知，筛选出的5个菌株产生ACC脱氨酶能力与产生IAA能力之间没有必然的相关关系。

图3 基于16S rDNA序列构建的产ACC脱氨酶细菌菌株与其他菌株的系统发育树

表2 5株产ACC脱氨酶细菌菌株与其同源性最高模式菌株的16S rDNA序列比对结果

2.3.2 产铁载体能力 筛选的5株菌均可在CAS平板上产生橙黄色晕圈，但是晕圈范围都较小(图5)，表明各菌株均能产生铁载体，但能力都较弱。

2.3.3 菌株溶磷能力 各菌株的溶磷圈及菌落大小见图6。测定BL、CL1、CL2、DL和DS菌株的溶磷圈直径(D)与菌落直径(d)，计算D/d分别为：1.76，1.79，1.64，1.62和2.41，表明这些菌株都具有较好的无机磷溶解能力[19]。

图4 筛选的产ACC脱氨酶细菌产IAA的能力

3 讨 论

目前，前人已经从不同植物根际分离出多个能产生活性ACC脱氨酶的细菌，其分别属于不同的科、属[20]，因此该类菌的存在和分布具有一定的普遍性。本试验以ACC为惟一氮源进行定向筛选，从旱地小麦的根际土壤中筛选出5株产ACC脱氨酶的菌株，其中2株鉴定为阿氏肠杆菌，其余3株分别为肺炎克雷伯氏菌、路德维希肠杆菌、非脱羧勒克氏菌。阿氏肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌和路德维希肠杆菌作为产ACC脱氨酶菌已有报道[21]；而非脱羧勒克氏菌则是首次作为能产ACC脱氨酶的菌株被分离出来，其促生效果及机制还有待进一步研究。此外，在所分离的5株根际促生菌中，肠杆菌科肠杆菌属处于优势地位，但未分离出目前报道较多的假单胞菌科假单胞菌属的菌株，这与王平等[22]的研究结果一致。

图5 筛选的产ACC脱氨酶细菌的产铁载体能力

图6 筛选的产ACC脱氨酶细菌的溶磷能力

研究显示，在干旱条件下，用产ACC脱氨酶的细菌AcbrombacterpiecbaudiiARV8接种番茄和胡椒幼苗，可以降低干旱诱导的乙烯水平，并且提高复水时植物的恢复能力[23]；用产ACC脱氨酶细菌Pseudomonasspp.接种豌豆，可以抑制由过量乙烯所造成的三重反应，显著促进和提高干旱胁迫下豌豆的生长和产量[24]；用产ACC脱氨酶细菌接种小麦，可显著降低干旱胁迫对小麦生长的负面影响[25]。本研究从旱地小麦根际土壤筛选出5株产ACC脱氨酶细菌，其ACC脱氨酶活性都较高，且都可以产生适量IAA[26]和少量铁载体，并有较好的溶解无机磷的能力。因此，这5个细菌是典型的产ACC脱氨酶根际促生菌[9]，对寄主植物有较强的促进生长的潜力，其是否可以应用于旱地小麦生产中还需进一步研究。

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