秦农142抗条锈病特征与成株期抗性遗传分析

邱亨池，王琪琳，何雨洁，侯夏乐，李 露，郭文洋，康振生，韩德俊

(西北农林科技大学 a 旱区作物逆境生物学国家重点实验室，b 农学院，c 植物保护学院，陕西 杨凌 712100)

小麦条锈病是由病原条锈菌(Pucciniastriiformisf.sp.tritici,Pst)引起的气流传播性小麦病害，其传播速度快，危害范围广、程度高[1]。自建国以来，小麦条锈病在我国有多次比较大的流行，给我国粮食生产造成了巨大的损失。运用抗病品种、改良抗病基因、合理基因布局是防治小麦条锈病最简便、有效、经济且对环境友好的措施。我国小麦栽培品种遗传基础狭窄，抗病基因单一，原始抗源主要集中在南大、阿夫、阿勃、青春系等单一品系材料中[2]，而随着小麦条锈菌的不断变异进化，这些抗病材料的抗锈性迅速被克服。如今，各麦区栽培的小麦抗病品种的抗病基因主要为Yr26，其对各麦区广泛流行的致病菌系CYR32、CYR33有很好的抗性。而新近于四川省发现的新条锈菌致病菌系CH42已克服抗病基因Yr26的抗性，值得特别关注。成株期抗性具有抗谱广、延缓病害流行、防病保产和延长抗病持久性等特点[3]。因此，加强对成株期抗性材料的收集和研究对于条锈病防治具有十分重要的意义。

秦农142是以郑州8329为母本、植87135-2-1-2-9为父本杂交选育而成的小麦新品种，其农艺性状优良，产量高，对白粉病、赤霉病及纹枯病抗性良好[4]。本课题组连续多年在陕西杨凌和甘肃天水两地自然条件下对秦农142苗期和成株期抗性进行鉴定，发现其苗期对少数条锈菌菌系表现中度或高度感病，而成株期表现为广谱抗条锈病特征，具有成株期抗病性。为了更好地利用秦农142的成株期抗锈性，发掘其抗条锈新基因，本研究利用基因推导和Yr基因分子检测等手段，分析秦农142可能携带的抗锈病基因，并通过与感病品种Avocet S(AvS)杂交，分析各世代的抗性表现，以明确秦农142成株期抗条锈病的遗传规律。

1 材料与方法

1.1 材 料

本试验用12个条锈菌菌系进行抗病接种鉴定，其中巴基斯坦菌系PK-CDRD、匈牙利菌系Hu09-2和澳大利亚菌系104E137A为国外优势流行小种，由华盛顿州立大学陈贤明教授惠赠；CYR23、CYR29、CYR31、CYR32、CYR33、CH42、Sull-4、Sull-5和Sull-7等9个条锈菌菌系由西北农林科技大学植物病理研究所提供。其中，CYR23、CYR29、CYR31小种是我国20世纪末期各麦区优势流行小种；CYR32、CYR33是我国当前各麦区优势流行小种；Sull-4、Sull-5、Sull-7为潜在的优势流行小种；CH42为新近在四川麦区发现的小种[5]，其可以侵染携带抗锈病基因Yr26的小麦，也是潜在的流行小种。所有条锈菌菌系经过鉴定、纯化后，隔离繁殖备用。7个已知抗条锈病单基因系抗性材料(Yr5、Yr9、Yr10、Yr15、Yr17、Yr18、Yr26)由华盛顿州立大学陈贤明教授提供；抗病材料秦农142及感病材料AvS和Chinese Spring(CS)由西北农林科技大学植物病理研究所提供。

1.2 方 法

1.2.1 成株期抗条锈性鉴定 2010-2012年，分别在陕西杨凌西北农林科技大学植物病理研究所人工混合小种诱发圃和甘肃天水自然诱发圃种植抗病品种秦农142及感条锈病对照材料AvS和CS，鉴定秦农142成株期的抗性水平。

1.2.2 苗期分小种抗性鉴定 小麦苗期抗性鉴定在西北农林科技大学植物病理学研究所温室进行。将秦农142及7个已知抗条锈病单基因系材料种植在直径为10 cm的瓦盆中，待小麦幼苗生长至2叶完全伸展时，采用抖粉法分别接种12个条锈菌菌系的孢子，在16～18 ℃条件下于保湿桶中存放24 h后，转至温室中培养，条件为：温度22 ℃以下，光照强度9000 lx，16 h/8 h光暗周期。以感病品种AvS和CS为对照。待对照品种充分发病后(接种后约15～18 d)，记载抗条锈病单基因系材料和亲本秦农142的抗病表型，按文献[6]中的方法，以 0-9 级标准记载抗病反应型(Infection type,IT)，按0，1%，5%，10%，30%，60%，80%和 100% 8级标准记载严重度(Severity，S)[1]。

1.2.3 已知抗病基因的分子检测 取秦农142新鲜不带条锈菌菌落的叶片，运用CTAB法提取基因组DNA，保存在-20 ℃冰箱中备用。以单基因系抗性材料为阳性对照，AvS为阴性对照，以应用广泛的抗条锈病基因Yr5[7]、Yr9[8]、Yr10[9]、Yr15[10]、Yr17[11]、Yr18[12]及Yr26[13]的分子标记对亲本材料秦农142进行分子标记检测，各基因分子标记的引物信息见表1，按照文献[7]的方法进行PCR扩增和产物检测。

1.2.4 秦农142成株期抗条锈性遗传分析 以秦农142为父本，与母本AvS杂交,获得F1代。将F1套袋自交获得F2群体，群体大小为212个单株。对F2群体接种混合条锈菌小种，以鉴定其成株期抗条锈性，记载单株的抗病反应型和严重度，分析抗感分离比。F2单株收获得F2∶3家系群体，记载F2∶3家系的抗病反应型和严重度，并根据F2∶3家系的抗病表型，验证F2单株抗病性鉴定结果，并推测其抗病基因型。

表1 已知抗小麦条锈病基因的分子标记

2 结果与分析

2.1 秦农142成株期抗条锈性的鉴定

连续3年在杨凌人工混合小种诱发圃和天水自然诱发圃的抗病性鉴定结果(表2)表明，抗条锈病品种秦农142在两地均为高度抗病(IT≤2，S≤5%)，而对照感病品种AvS在两地均表现为高度感病(IT≥8，S≥80%)；CS在两地除2010年人工诱发圃严重度为60%外，其余均表现为高度感病(IT≥8，S≥80%)。说明抗病品种秦农142在成株期具有高度的抗病性。

表2 秦农142小麦成株期抗病表型

2.2 秦农142苗期抗病表现及抗病基因推导

苗期抗病性鉴定结果(表3)显示，秦农142苗期对当前各麦区优势流行菌系CYR32高度感病(IT为8)，对潜在的优势流行小种Sull-4中度抗病(IT为5)，对菌系PK-CDRD也为中度抗病(IT为3)，对其余9个致病菌系表现高度抗病(IT为0～2)，表明抗病品种秦农142含有主效抗条锈病基因，但其对毒性小种CYR32没有抗性，成株期秦农142对CYR32的抗性可能由成株期抗病基因决定。

采用12个条锈菌生理小种对秦农142的抗病基因分布进行初步筛查，通过与已知含有抗条锈病基因的单基因系材料进行对比，可以对秦农142含有的已知抗条锈病基因做出初步断定。因此，本研究根据Dubin等[14]提出的基因推导六原则,对比含有已知基因的单基因系材料抗病谱，进而推导秦农142中含有的抗病基因。抗条锈病基因Yr5、Yr10及Yr15的抗性谱(表3)显示，三者对所有供试条锈菌菌系均表现高度抗病，抗条锈病基因Yr26仅对条锈菌菌系CH42表现感病，对其他供试菌系均表现抗病，而秦农142苗期对CYR32表现感病，说明秦农142中不含抗条锈病基因Yr5、Yr10、Yr15或Yr26。抗条锈病基因Yr9、Yr17和Yr18的单基因系材料对CYR32均表现感病，对其他供试的11个菌系分别表现不同程度的感病，秦农142对相应的条锈菌菌系表现为典型的低反应型，说明其可能含有抗条锈病基因Yr9、Yr17和Yr18，这需进一步通过分子检测来确证。

表3 秦农142小麦及抗条锈病单基因系小麦材料的苗期抗病谱

2.3 秦农142抗病基因的分子标记分析

选用7个常见抗条锈病基因已知分子标记检测秦农142所含有的抗病基因，结果(表4)在分子标记S19M93的检测中，通过和Yr5单基因系材料抗病谱(表3)对比分析可知，秦农142中不含有Yr5，此处检测结果为假阳性；其余6个分子标记的检测结果均为阴性。综合基因推导和分子标记的检测结果可知，秦农142中不含有Yr5、Yr9、Yr10、Yr15、Yr17、Yr18和Yr26等7个已知的抗条锈病基因，其苗期的专化抗性可能是由未知抗病基因所决定的，这需要进一步研究。

表4 秦农142小麦及抗条锈病单基因系小麦材料的分子标记检测

2.4 秦农142成株期抗条锈病的遗传分析

表5 自然条件下秦农142与AvS杂交各世代成株期的抗条锈病表现

3 讨 论

具有成株期抗性的小麦品种对条锈菌的抗性表现为广谱性和持久性，能延缓病害发生，降低条锈病的危害[15-16]，因此挖掘不同的成株期抗性抗源对小麦持久抗性品种的选育具有重要意义。经过多年多点的验证，秦农142不论是在杨凌人工混合小种诱发圃，还是在病原菌变异频繁的天水自然诱发圃，其成株期均表现高度抗病，苗期对当前各麦区流行小种CYR32表现高度感病，表明秦农142成株期对CYR32的抗性由成株期抗病基因介导，是典型的成株期抗源品种，具有重要的利用价值。在后期的研究中，应扩大遗传群体，结合表型数据，运用分子标记筛选技术，定位成株期相关抗病基因[17-18]。

明确抗源所携带的抗病基因对抗源的开发利用至关重要。本研究中，苗期以12个条锈菌致病菌系进行接种鉴定，结果表明秦农142苗期对供试条锈菌菌系CYR32感病，对其他11个菌系均表现高度抗病或中度抗病，表明其苗期抗病表型良好，含有苗期小种专化抗病基因。采用基因推导的方法建立7个已知抗病基因的抗性谱，对比分析秦农142的抗病表现，推测其苗期抗病主效基因。基因推导法则是由Dubin等在总结前人经验的基础上提出的，为利用材料的抗病表现推断其基因型，并摸清其遗传特点提供了方法和指导。基因推导方法容易受寄主遗传背景、病原物鉴别力、环境条件及人为因素的影响而造成误差[19]。本试验结合分子标记检测技术，对其所携带苗期小种专化抗条锈病基因存在与否提供了另一方面的证据，从而使试验结果更加准确和可靠[20]。通过在杨凌建立F1、F2遗传群体及衍生F2∶3遗传家系，遗传分析结果表明，秦农142成株期抗病性是由1对显性和1对隐性基因共同决定的。本研究明确了秦农142苗期和成株期的抗病特征，初步筛查了其苗期小种专化抗病基因，分析了成株期的抗病遗传机制，为后续更加深入地研究及挖掘抗病基因奠定了一定的基础。秦农142苗期抗病表型优异，成株期具有广谱抗条锈病的特征，是很好的抗条锈病育种材料。

[参考文献]

[1] 李振岐,曾士迈.中国小麦锈病 [M].北京:中国农业出版社,2002.

Li Z Q,Zeng S M.Wheat rust in China [M].Beijing:China Agriculture Press,2002.(in Chinese)

[2] 魏国荣,韩德俊,赵 杰，等.小麦成株期抗条锈病种质筛选与评价 [J].麦类作物学报,2011,31(2):376-381.

Wei G R,Han D J,Zhao J,et al.Identification and evaluation of adult plant resistance to stripe rust in wheat germplasms [J].Journal of Triticeae Crops,2010,31(2):376-381.(in Chinese)

[3] 韩德俊，王琪琳，张 立,等.“西北-华北-长江中下游”条锈病流行区系当前小麦品种(系)抗条锈病性评价 [J].中国农业科学,2010,43(14):2889-2896.

Han D J,Wang Q L,Zhang L,et al.Evaluation of resistance of current wheat cultivars to stripe rust in northwest China,north china and the middle and lower reaches of changjiang river epidemic area [J].Scientia Agricultura Sinica,2010,43(14):2889-2896.(in Chinese)

[4] 杜运科,任雅琴,陈三乐，等.国审小麦新品种秦农142选育研究 [J].中国农业科技导报,2009,11(S2):112-115.

Du Y K，Ren Y Q，Chen S L,et al.Selection and breeding of the new state approved wheat variety Qinnong 142 [J].Journal of Agricultural Science and Technology,2009,11(S2):112-115.(in Chinese)

[5] Liu T G,Peng Y L,Chen W Q,et al.First detection of virulenceinPucciniastriiformisf.sp.triticiin China to resistance genesYr24(=Yr26) present in wheat cultivar Chuanmai 42 [J].Plant Disease,2010,94(9):1163.

[6] McNeal F H,Konzak C F,Smith E P,et al.A uniform system for recording and processing cereal research data [S].Washington:United States Department of Agriculture,1971.

[7] Smith P H,Hadfield J,Hart N J,et al.STS markers for the wheat yellow rust resistance geneyr5 suggest a nbs-lrr-type resistance gene cluster [J].Genome,2007,50(3):259-265.

[8] Francis H A,Leitch A R,Koebner R M D.Conversion of a RAPD-generated pcr product,containing a novel dispersed repetitive element,into a fast and robust assay for the presence of rye chromatin in wheat [J].Theoretical and Applied Genetics,1995,90(5):636-642.

[9] Singh R,Datta D,Priyamvada,et al.A diagnostic PCR based assay for stripe rust resistance genein wheat [J].Acta Phytopathologica et Entomologica Hungarica,2009,44(1):11-18.

[10] Murphy L R,Santra D,Kidwell K,et al.Linkage maps of wheat stripe rust resistance genesyr5 andyr15 for use in marker-assisted selection [J].Crop Science,2009,49(5):1786-1790.

[11] Helguera M,Khan I A,Kolmer J,et al.PCR assays for thelr37-yr17-sr38 cluster of rust resistance genes and their use to develop isogenic hard red spring wheat lines [J].Crop Science,2003,43(5):1839-1847.

[12] Lagudah E S,Krattinger S G,Herrera-Foessel S,et al.Gene-specific markers for the wheat geneLr34/Yr18/Pm38 which confers resistance to multiple fungal pathogens [J].Theoretical and Applied Genetics,2009,119(5):889-898.

[13] Wang C,Zhang Y，Han D,et al.SSR and STS markers for wheat stripe rust resistance geneYr26 [J].Euphytica,2008,159(3):359-366.

[14] Dubin H J,Johnson R,Stubbs R.Postulated genes for rensistance to stripe rust in selected CIMMYT and related wheats [J].Plant Disease,1989,73:472-475.

[15] 杨作民.小麦对条锈病水平抗性育种方法研究:准水平抗性材料的搜集和筛选 [J].中国农业大学学报,1998,3(5):79-84.

Yang Z M.Studies on breeding for horizontal resistance against wheat stripe rust:Collection of and screening for materials that might possess horizontal resistance [J].Journal of China Agricultural University,1998,3(5):79-84.(in Chinese)

[16] Chen X M,Tristan C,Huang X L,et al.Understanding molecular mechanisms of durable and non-durable resistance to stripe rust in wheat using a transcriptomics approach [J].Current Genomics,2013,14:111-126.

[17] Mago R,Miah H,Lawrence G J.High-resolution mapping and mutation analysis separate the rust resistance genesSr31,Lr26 andYr9 on the short arm of rye chromosome 1 [J].Theoretical and Applied Genetics,2005,112:41-50.

[18] Zhang X J,Han D J,Zeng Q D,et al.Fine mapping of wheat stripe rust resistance geneyr26 based on collinearity of wheat withBrachypodiumdistachyonand rice [J].Plos One,2013,8(3):e57885.

[19] 袁军海,刘太国,陈万权.中国47个小麦新品种(系)苗期抗叶锈基因推导 [J].中国农业科学,2007,40(9):1925-1935.

Yuan J H,Liu T G,Chen W Q.Postulation of leaf rust resistance genes in 47 new wheat cultivars (lines) at seedling stage [J].Scientia Agricultura Sinica,2007,40(9):1925-1935.(in Chinese)

[20] 王 海,华秋东,陈维多.小麦抗条锈病基因分子标记及定位研究进展 [J].东北农业大学学报,2009,40(3):131-135.

Wang H,Hua Q D,Chen W D.Progress of molecular marker and mapping of genes resistant to stripe rust in wheat [J].Journal of Northeast Agricultural University,2009,40(3):131-135.(in Chinese)