谷胱甘肽存在条件下对玉米植株干旱胁迫的缓解作用

徐一馨，王 飞，张成双，慕自新

(西北农林科技大学 生命科学学院，陕西 杨凌712100)

随着全球气候的变化，干旱发生的频率和持续的时间均在增加，对粮食安全造成了严重的威胁[1]。一氧化氮(NO)几乎在哺乳动物细胞中参与了所有的生理活动，如心血管放松、神经递质转导、平滑肌放松以及免疫反应等[2]；在植物中，NO参与了植物生长发育及对外界胁迫反应等多种生理过程，包括促进种子萌发、降低种子休眠、调节植物的成熟和衰老、抑制植物开花等[3-5]。当受到生物和非生物胁迫时，植物体产生的内源NO经过一系列的信号转导，通过调节气孔运动、激活抗氧化酶或者诱导胁迫应答基因的表达等方式来行使抗逆功能[6-7]。而体外施加NO，也可以增强植物对环境逆境(干旱、高盐、冷(冻)害、磷亏缺、重金属、UV-B辐射、除草剂和病原等)的抗性[8-9]。

1 材料与方法

1.1 材 料

供试玉米种子为郑丹958，购自陕西杨凌金诺种业公司。营养基质于2012-04购自杨凌正高肥料有限公司，其营养成分为N+P2O2+K2O≥1%，腐殖酸≥10%,有机质≥20%，EC≤1.8 mS/cm。GSH购自Sigma公司，NaNO2购自西陇制药公司。

1.2 幼苗的培养与处理

1.2.1 幼苗培养 选择适量籽粒饱满、大小一致的玉米种子，先用质量分数10%次氯酸钠消毒15 min，自来水冲洗数次，再用蒸馏水浸泡过夜，使其充分吸水。之后，将玉米种子放在垫有1层海绵的托盘中，在28 ℃的温箱中黑暗催芽。将营养土分装到规格为10 cm×11 cm2的黑色盆钵中，每盆装土约0.262 kg，再将各个盆钵浸水24 h，使其充分吸水；待玉米种子露白后，挑选生长一致的萌发种子移植到盆钵中。然后将发芽种子置于光照培养间(光照强度100 μmol/(m2·s)，光暗时数14 h/10 h，昼夜温差28 ℃/20 ℃，空气相对湿度70%)中培养。

1.2.2 GSNO的制备 将等体积的10 mmol/L NaNO2(在100 mmol/L HCl中)与等体积的10 mmol/L GSH(在100 mmol/L pH 7.4的磷酸缓冲液中)反应，即可形成5 mmol/L GSNO。将5 mmol/L GSNO稀释成需要的浓度(50，100，250，500，800，1 000 μmol/L)。室温条件下，在100 mmol/L pH 7.4的磷酸缓冲液中(内含50 μmol/L DTT)，GSNO可以释放出NO，其中500 μmol/L GSNO 30 min释放出的NO浓度约为 3.25 μmol/L[12]。

1.2.3 幼苗处理 参照Bethke等[13]的方法，待玉米幼苗长到三叶一心时，挑选长势一致的幼苗，分别将50，100，250，500，800，1 000 μmol/L GSNO连同植株一同放置到密闭的培养箱中，气体熏蒸3 h。采用人工控水法对所有幼苗进行干旱胁迫，使土壤相对含水量(RWC)为55%～45%。先充分供水至RWC的上限，之后2 d称质量1次，待RWC降至下限时采取微量给水法保证土壤含水量。试验设置干旱胁迫对照(即只单独进行干旱胁迫，不进行GSNO处理)，分别于干旱胁迫后的1，4和7 d，取干旱对照和各处理植株的倒二叶, 进行生长和生理指标的测定。

1.3 测定指标与方法

1.3.1 株高、茎粗和叶面积 干旱胁迫7 d后分别用直尺和游标卡尺测量玉米植株的株高和茎粗。叶面积采用Francis等[14]的方法进行测算，即叶面积=叶长×叶宽×叶面积系数(0.75)，每组数据重复测量8次取平均值。

1.3.2 叶片失水速率 将干旱胁迫7 d幼苗的离体叶片放置在光强度为200 μmol/(m2·s)的白炽灯下，1 h后称量叶片1次，共测量6次，分别记录叶片离体1～6 h时质量的变化；最后，将离体叶片置80 ℃烘箱干燥至质量恒定，称取叶片干质量，求失水速率。

1.3.3 抗氧化酶活性 将用液氮研磨干旱胁迫1，4和7 d的幼苗倒二叶约500 mg，溶解于50 μmol/L的磷酸钾缓冲液(包含1 mmol/L EDTA、质量分数1%的PVP)中，在4 ℃、15 000×g下离心20 min，取上清液用Elavarthi 等[15]的方法测定抗氧化酶活性。

1.3.5 光合色素含量 采用质量测定法，取不同处理植株叶片剪匀(0.2 cm×2 cm，避开叶脉)，称取 0.1～0.2 g放入试管中，加入0.5 mL纯丙酮和10 mL体积分数80%的丙酮，用封口膜封住试管，将试管放入摇床于黑暗处浸提过夜，直到发白为止。利用UV-2450型紫外可见分光光度计分别在波长663，645和470 nm处测定吸光度值，然后计算叶绿素总量和叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素含量[18]。

1.3.6 丙二醛(MDA)含量 采用Zhao等[19]的方法进行测定。

1.4 数据处理

试验数据用“平均值±标准差”表示。用DPS软件对数据进行方差分析和新复极差法比较，用Origin软件做图。

2 结果与分析

2.1 GSNO处理对干旱胁迫玉米幼苗生长的影响

由图1可知，干旱胁迫7 d后，干旱对照的玉米植株严重倒伏并萎蔫，且叶片均出现卷曲；50～1 000 μmol/L GSNO处理的玉米植株叶片顶部虽略有萎蔫，但仍呈舒张状态，茎干部位仍然直挺，也未见严重枯萎。

图1 GSNO处理对干旱胁迫玉米幼苗生长的影响

表1显示，干旱对照组植株地上部分生长指标均显著低于GSNO处理组，说明GSNO处理液产生的NO能够极大缓解干旱对玉米幼苗地上部生长的影响，进而维持植株的正常生长。与干旱对照组相比，GSNO浓度为250与500 μmol/L时，其抗旱能力得到最大发挥，其中在500 μmol/L GSNO处理下，玉米幼苗的株高、茎粗和叶面积分别较干旱对照提高32.26%，45.83%和53.13%。鉴于50,250,800 μmol/L GSNO处理后玉米形态的变化与50,500,1 000 μmol/L GSNO处理基本一致，故本试验后续研究中只分析50，500和1 000 μmol/L GSNO处理对玉米生理指标变化的影响。

表1 GSNO处理对干旱胁迫7 d玉米幼苗形态指标的影响

2.2 GSNO处理对干旱胁迫玉米幼苗叶片失水速率的影响

干旱胁迫7 d后，分别测定各处理玉米离体叶片的失水速率，结果如图2所示。由图2可知，干旱对照玉米离体叶片失水速率的下降趋势最为明显，到测定后期其叶片失水速率几乎降为0，表明叶片在离体6 h后其质量已经接近干质量；各GSNO处理组离体叶片失水速率的下降趋势相对较为平缓，其变化趋势表现为500 μmol/L<50 μmol/L<1 000 μmol/L，说明GSNO处理可以显著降低离体叶片的水分散失，并表现出一定的浓度依赖性。

图2 GSNO处理对干旱胁迫下玉米离体叶片失水速率的影响

2.3 GSNO处理对干旱胁迫玉米幼苗叶片活性氧代谢的影响

由图3可知，随着胁迫时间的延长，各处理玉米幼苗的SOD和GR活性均呈下降趋势，其中GR活性在干旱胁迫期间均显著高于干旱对照，500和1 000 μmol/L GSNO处理的SOD活性与干旱对照也存在显著差异。各处理的CAT活性均在干旱胁迫第4天达到最大值，之后有所下降，其中干旱对照的下降幅度明显大于其他处理。与胁迫1 d相比，各GSNO处理幼苗的APX活性在胁迫第4天时变化不大，到后期总体呈上升趋势，且GSNO处理幼苗的APX活性均显著高于干旱对照。各处理组相比，均以500 μmol/L GSNO处理对酶活的促进作用最明显。由此推论，与干旱对照相比，NaNO2+GSH产生的GSNO处理能使干旱胁迫幼苗中的抗氧化酶活性得以激活，从而增强了玉米的抗氧化能力。

2.4 GSNO处理对干旱胁迫玉米幼苗叶片H2O2和的影响

2.5 GSNO处理对干旱胁迫玉米幼苗光合色素含量的影响

由图5可见，随着干旱胁迫时间的延长，各处理玉米叶片中的叶绿素总量、叶绿素a和叶绿素b含量总体上呈降低趋势。但与干旱对照相比，干旱胁迫期间500 μmol/L GSNO处理玉米幼苗的叶绿素总量和叶绿素a含量均显著增高，干旱胁迫1，4，7 d时其叶绿素总量分别较干旱对照增加10.12%，27.64% 和8.50%，叶绿素a含量分别增加 21.12%，28.18%和7.29%。随着胁迫时间的延长，各处理的类胡萝卜素含量无明显变化规律，但GSNO处理的类胡萝卜素含量总体高于干旱对照。上述结果表明，在干旱胁迫条件下，尤其是在干旱胁迫初期阶段，经500 μmol/L GSNO处理后，玉米幼苗叶片的叶绿素和类胡萝卜素含量均有所提高。

图3 GSNO处理对干旱胁迫玉米幼苗抗氧化酶活性的影响

图4 GSNO处理对干旱胁迫玉米幼苗H2O2和含量的影响

图5 GSNO处理对干旱胁迫玉米叶片光合色素含量的影响

2.6 GSNO处理对干旱胁迫玉米幼苗膜脂过氧化的影响

图6显示，在干旱胁迫初期(1～4 d)，MDA含量在所有处理中基本保持不变，且各GSNO处理玉米幼苗的MDA含量均稍低于干旱对照。干旱胁迫7 d后，各处理的MDA含量虽有所增加，但仍明显低于干旱对照，表明GSNO处理降低了干旱胁迫下玉米幼苗的膜脂过氧化水平，增强了植株的抗逆性。

图6 GSNO处理对干旱胁迫玉米幼苗MDA含量的影响

3 结论与讨论

NO能否发挥作用及其发挥何种作用取决于其在植物体中的分布和浓度，低浓度NO可以降低ROS的水平，缓解亚硝基化胁迫，相反高浓度的NO可以引起氧化胁迫与亚硝基化损害[1,7]。由于NO具有两面性，因此维持合适的NO浓度至关重要。干旱胁迫可以打破细胞的氧化还原平衡，最终导致ROS的积累与氧化胁迫[20]，诱导植物体内NO的产生。Arasimowicz-Jelonek等[21]报道，当黄瓜(Cucurbitaceae)遭受微量水分亏缺时(5～10 h)，其根部伸长区就会有微量的NO产生；而当遭受严重水分亏缺时(17 h)根部会有大量NO产生；Guo等[10]报道，在干旱环境下豌豆(Pisumsativum)、小麦(Triticumaestivuml)以及烟草(Nicotianatabacum)中都会有NO的产生。

在干旱胁迫条件下，植物通过调节细胞分裂和细胞扩张主动重塑自身的生长发育过程，而NO正是通过调控气孔的开度，将生长发育和非生物逆境应答联系起来[23]。Tan等[22]施加SNP为外源NO，发现外源NO能够诱导气孔关闭，有利于维持较高的叶片含水量。本研究表明，干旱胁迫6 h时，各GSNO处理的离体玉米叶片的失水速率均明显低于干旱对照，其失水速率表现为500 μmol/L GSNO<50 μmol/L GSNO<1 000 μmol/L GSNO<干旱对照，这可能是由于NO诱导了气孔开度的减小所致[23]。光合色素不仅在植物吸收光能过程中发挥了重要作用，而且还能够增强植物的抗氧化能力，叶绿素a和叶绿素b对干旱比较敏感，而类胡萝卜素有抵御干旱的能力。Graziano等[24]发现，NO能够通过增加玉米叶片叶绿体膜上Fe离子的浓度来促进叶绿素含量的升高。本试验发现，GSNO处理可以提高干旱胁迫玉米幼苗的叶绿素和类胡萝卜素含量。

综上所述，500 μmol/L GSNO处理对玉米幼苗抗旱性的提高效果最为明显，该浓度也在已经鉴定的其他物种的最适GSNO处理浓度范围之内[15-21]。外施GSNO可以通过对植物生长的调控，维持植物体内的水分平衡，激活其抗氧化防御系统，增强ROS的清除能力及光合能力，进而增强玉米幼苗的抗旱性。

[参考文献]

[1] Mir R R,Zaman-Allah M,Sreenivasulu N,et al.Integrated genomics,physiology and breeding approaches for improving drought tolerance in crops [J].Theoretical and Applied Genetics,2012,125:625-645.

[2] Schmidt H H H W,Walter U.NO at work [J].Cell,1994,78:919-925.

[3] Delledonne M,Xia Y,Dixon R A,et al.Nitric oxide functions as a secondary signal in plant disease resistance [J].Nature,1998,934:585-588.

[4] Guo F Q,Okamoto M,Crawford N M.Identification of a plant nitric oxide synthase gene involved in hormonal signaling [J].Science,2003,302:100-103.

[5] He Y K,Tang R H,Yi H,et al.Nitric oxide represses theArabidopsisfloral transition [J].Science,2004,305:1968-1971.

[6] Besson-Bard A,Pugin A,Wendehenne D.New insights into nitric oxide signaling in plants [J].Annual Review of Plant Biology,2008,9:21-39.

[7] Siddiqui M H,Al-Whaibi M H,Basalah M O.Role of nitric oxide in tolerance of plants to abiotic stress [J].Protoplasma,2011,248:447-455.

[8] Shi H T,Li R J,Cai W,et al.Increasing nitric oxide content inArabidopsisthaliana by expressing rat neuronal nitric oxide synthase resulted in enhanced stress tolerance [J].Plant Cell Physiol,2012,53:344-57.

[9] Wang B L,Tang X Y,Cheng L Y,et al.Nitric oxide is involved in phosphorus deficiency-induced cluster-root development and citrate exudation in white lupin [J].New Phytologist,2010,187:1112-1123.

[10] Guo F Q,Crawford N M.Arabidopsisnitric oxide synthase is targeted to mitochondria and protects against oxidative damage and dark-induced senescence [J].The Plant Cell,2005,17:3436-3450.

[11] Zhao M G,Tian Q Y,Zhang W H.Nitric oxide synthase-dependent nitric oxide production is associated with salt tolerance inArabidopsis[J].Plant Physiology,2007,144:206-217.

[12] Sebastia J,Marcela S,Carlos G B,et al.Chloroplasts as a nitric oxide cellular source:Effect of reactive nitrogen species on chloroplastic lipids and proteins [J].Plant Physiol,2006,142:1246-1255.

[13] Bethke P C,Libourel I G,Jones R L.Nitric oxide reduces seed dormancy inArabidopsis[J].Journal of Experimental Botany,2006,57(3):517-526

[14] Francis C A,Rutger J N,Plamer A F E.A rapid method for plant leaf area estimation in maize (ZeaMaysL.) [J].Crop Science,1969,9:537-539.

[15] Elavarthi S,Martin B.Spectrophotometric assays for antioxidant enzymes in plants [J].Methods in Molecular Biology,2010,639:273-280.

[16] Brennan T,Frenkel C.Involvement of hydrogen peroxide in the regulation of senecence in pear [J].Plant Physiology,1977,59:411-416.

[17] Zhang A,Jiang M,Zhang J,et al.Nitric oxide induced by hydrogen peroxide mediates abscisic acid-induced activation of the mitogen-activated protein kinase cascade involved in antioxidant defense in maize leaves [J].New Phytologist,2007,175:36-50.

[18] 高俊凤.植物生理学实验指导 [M].北京:高等教育出版社,2006.

Gao J F.The experimental guidance of plant physiology [M].Beijing:Higher Education Press,2006.(in Chinese)

[19] Zhao S J,Xu C C,Zou Q,et al.Improvements of method for measurement of malondialdehyde in plant tissues [J].Plant Physiology Communication,1994,30:207-209.(in Chinese)

[20] Farooq M,Wahid A,Kobayashi N,et al.Plant drought stress:Effects,mechanisms and management [J].Agronomy for Sustainable Development,2009,29:185-212.

[21] Arasimowicz-Jelonek M,Floryszak-Wieczorek J,Kubis J.Interaction between polyamine and nitric oxide signaling in adaptive responses to drought in cucumber [J].Journal of Plant Growth Regulation,2009,28:177-186.

[22] Tan J,Zhao H,Hong J,et al.Effects of exogenous nitric oxide on photosynthesis,antioxidant capacity and proline accumulation in wheat seedlings subjected to osmotic stress [J].World J Agricul Sci,2008,4:307-313.

[23] Hancock J T,Neill S J,Wilson I D.Nitric oxide and ABA in the control of plant function [J].Plant Science,2011,181:555-559.

[24] Graziano M,Lamattina L.Nitric oxide and iron in plants:An emerging and converging story [J].Trends Plant Sci,2005,10:4-8.