自噬相关基因Beclin1和MAP1LC3B在胆囊癌组织中的表达及其意义

申增强　王世明　王小峰

[摘要] 目的 检测自噬基因Beclin1、MAP1LC3B在原发性胆囊癌组织中的表达情况，探讨细胞自噬在胆囊癌发生中的作用及其临床意义。 方法 采用免疫组织化学SP方法，检测Beclin1、MAP1LC3B在胆囊癌组织中的表达情况，并以同期手术切除的胆囊炎性疾病组织为对照；统计Beclin1和MAP1LC3B的表达情况，并分析其与胆囊癌临床病理特征之间的关系。 结果 胆囊癌组和慢性胆囊炎组Beclin1的阳性表达率分别为45.7%和78.3%，MAP1LC3B的阳性表达率分别为47.8%和71.7%，两组差异有统计学意义（P<0.05）。Beclin1和MAP1LC3B在不同年龄、性别、癌组织分化程度患者中的表达水平差异无统计学意义（P>0.05），但与周围脏器侵犯情况、病理TNM分期有关（P<0.05）。Beclin1和MAP1LC3B在胆囊癌组织中的表达水平呈正相关（r=0.538，P<0.01）。结论 胆囊癌组织中Beclin1和MAP1LC3B表达水平明显低于胆囊炎性疾病组织；Beclin1和MAP1LC3B的表达水平与胆囊癌侵袭能力及TNM分期有关，且两者表达呈正相关；提示Beclin1和MAP1LC3B是反映胆囊癌生物学行为的重要指标，两者之间可能存在着某种共同通路。

[关键词] Beclin1；MAP1LC3B；胆囊癌

[中图分类号] R735.8 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2014）02（b）-0007-04

胆囊癌是胆道系统中最常见的恶性肿瘤，在消化系统恶性肿瘤中居第5位[1]。胆囊癌发病隐匿，恶性程度高，早期常无特殊临床症状，大量临床资料报道多患者在明确诊断时多已处于中、晚期，其中晚期患者5年生存率<5%[2]。胆囊癌的发病机制目前仍不明确。自噬作为Ⅱ型程序性细胞死亡，已证实与肿瘤的发生、进展及肿瘤血管的形成等有关。Beclin1作为自噬形成过程中的一种重要正性调控因子，通过提高细胞自噬，能抑制肿瘤生长，是候选的抑癌靶基因[3]。有研究表明，微管相关蛋白1轻链3B（MAP1LC3）家族基因（MAP1LC3A、MAP1LC3B、MAP1LC3C）是重要的自噬相关基因，其中MAP1LC3B 和MAP1LC3C 参与了乳腺癌细胞的自噬[4-5]。目前，有关Beclin1和MAP1LC3B 在胆囊癌中表达的研究较少。本文旨在检测Beclin1和MAP1LC3B在胆囊癌中的表达情况，并探究其临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2008年1月～2011年12月山西医科大学第一附属医院普外科46例胆囊癌患者癌组织标本，取同期手术切除的46例慢性胆囊炎患者胆囊炎性组织作为对照。46例胆囊癌患者中，男20例，女26例，年龄43～80岁，平均65.5岁；46例胆囊炎患者中，男22例，女24例，年龄23～75岁，平均42.5岁。其中，腺癌40例，鳞癌6例；病理分级：低分化15例，中分化23例，高分化8例。患者术前均未接受任何放疗、化疗及生物、免疫治疗。所取标本均经甲醛固定，石蜡包埋，切片后用免疫组织化学方法检测。

1.2 试剂及方法

兔抗人Beclin1、MAP1LC3B单克隆抗体购于武汉三鹰生物技术有限公司，分别按1∶150及1∶200的比例稀释后作一抗，二抗和DAB显色试剂盒均购自北京中杉金桥生物公司。按SP法说明，进行免疫组织化学检测操作。采用阳性肿瘤标本作为阳性对照，用PBS代替一抗作为阴性对照。

1.3 结果判定标准

Beclin1与MAP1LC3B为淡黄色到棕褐色表达，颗粒状或均质状分布，Beclin1阳性表达见于细胞质和细胞膜；MAP1LC3B阳性表达见于细胞质。随机选择镜下5个高倍视野观察，计算1000个细胞，综合阳性细胞比率和着色深度评估，阳性细胞百分比<5%为0分，5%～50%为1分，～75%为2分，>75%为3分；细胞无着色评0分，淡黄色评1分，棕黄色评2分，棕褐色评3分。结果取2项评分之积，0分表示阴性；1～9分表示阳性。

1.4 统计学方法

采用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析；计数资料的比较采用χ2检验或者Fisher确切概率法；相关性采用等级相关的Spearman检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 免疫组织化学检测结果

2.1.1 Beclin1表达情况 在胆囊癌组织及胆囊炎性组织中均有Beclin1表达，胆囊癌中Beclin1的阳性表达率（45.7%）显著低于胆囊炎性组织（78.3%）（P<0.05）（图1）。

图1 胆囊癌及慢性胆囊炎组织Beclin1表达免疫组织化学检测结果

A.慢性胆囊炎；B.低分化胆囊癌；C.中分化胆囊癌；D.高分化胆囊癌

2.1.2 MAP1LC3B表达情况 MAP1LC3B 在胆囊癌和胆囊炎性组织中均有表达，胆囊癌中MAP1LC3B的阳性表达率（47.8%）明显低于胆囊炎性组织（71.7%）（P<0.05）（图2）。

图2 胆囊癌及慢性胆囊炎组织MAP1LC3B表达免疫组织化学检测结果

A.慢性胆囊炎；B.低分化胆囊癌；C.中分化胆囊癌；D.高分化胆囊癌

2.2 Beclin1和MAP1LC3B表达情况与胆囊癌临床病理特征的关系

Beclin1和MAP1LC3B在不同年龄、性别、癌组织分化程度患者中的表达水平差异无统计学意义（P>0.05），但与周围脏器侵犯情况、TNM分期有关（P<0.05）（表1）。

表1 胆囊癌组织中Beclin1和MAP1LC3B的表达情况与临床病理特征的关系（n）

2.3 Beclin1与MAP1LC3B 表达的相关性

Spearman 相关分析显示，Beclin1与MAP1LC3B在胆囊癌组织中表达呈正相关（r=0.538，P<0.01）（表2）。

表2 Beclin1和MAP1LC3B在胆囊癌组织中表达的相关性（n）

3 讨论

自噬介导的细胞死亡不同于凋亡（Ⅰ型程序性死亡），被称为Ⅱ型程序性死亡。自噬过程在生物进化过程中高度保守，从低等生物酵母、果蝇到高等生物人均能找到自噬过程的同源基因。双层膜结构包裹部分或整个细胞成分，形成自噬泡，然后与溶酶体结合，形成自噬溶酶体，导致被包裹的物质和自噬体内膜的降解。通过自噬过程，细胞实现氨基酸、核酸等生物分子的循环使用[7]，维持内环境稳态，清除衰老和无功能的细胞，抑制癌细胞过度增殖，清除病原微生物[8]。

自噬体的形成与自噬相关基因（ATG）有关[9]。自噬体的形成过程中有3个关键步骤：ULK1丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶、ATG13和FIP200形成ULK1复合物；Beclin1与Ⅲ型PI3K形成复合体；微管相关蛋白轻链3（LC3）的脂化[10]。

Beclin1位于人染色体17q21上，大小约为150 kb，是酵母ATG6基因的同源物。Beclin1参与诱导自噬泡的行成。Beclin1与Ⅲ型PI3K形成复合体，能调控其他自噬蛋白在自噬前体中的结构定位[11]。研究发现，抗凋亡蛋白Bcl-2和Beclin1结合后，抑制Beclin1活性，降低自噬水平[12]。Liang等[13]发现与正常乳腺上皮结构中Beclin1蛋白高表达不同，乳腺癌组织中Beclin1表达显著降低。此后诸多研究阐明，与正常组织对比，Beclin1在食管癌[14]、卵巢癌[15]、喉癌[16]等多种肿瘤组织中的表达均明显降低，表明自噬对肿瘤的发生、发展有一定的抑制作用。

LC3是酵母ATG8基因的类似物，定位于自噬前体和自噬泡的膜表面。MAP1LC3B是编码自噬相关蛋白的重要基因。在缺氧状态下，MAP1LC3B和ATG5表达能调控转录子ATF4介导的肿瘤细胞转移[17]。人MAP1LC3B并没有发生羧基端的切割反应，而且羧基端的甘氨酸被赖氨酸代替，成为人MAP1LC3B发生修饰反应的活性位点。人LC3A的膜定位与Gly120位点的切割和修饰密切相关，进一步研究表明参与其修饰的分子也与其他基因不同，以上结果提示MAP1LC3B存在翻译后修饰羧基端切割自噬作用[18-19]。

恶性肿瘤的转移是一个多基因共同参与的多阶段过程，Beclin1和MAP1LC3可能与其他调控自噬的基因共同作用，抑制肿瘤转移。有研究表明PTEN可下调ClassⅠPI3K活性通路，可能使血管内皮细胞发生自噬性死亡，抑制新生血管形成，抑制肿瘤转移。

综上所述，Beclin1与MAP1LC3B在胆囊癌中表达水平降低，说明自噬活性的降低参与胆囊癌的发生、发展。在肿瘤中，自噬起着“双刃剑”的作用，在低氧条件下，自噬可以通过能量物质的循环使用，避免细胞死亡；但自噬又是重要的细胞死亡途径。而自噬在胆囊癌中的具体调控机制有待进一步研究。

[参考文献]

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[3] Liang XH，Jackson S，Seaman M，et al.Induction of autophagy and inhibition of tumorigenesis by beclin1[J].Nature，1999， 402（6762）：672-676.

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[7] Kroemer G，Levine B. Autophagic cell death：the story of a misnomer[J].Nat Rev Mol Cell Biol，2008，9（12）：1004-1010.

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