扁平苔藓皮损中IL—17、FoxP3和Caspase—3的表达及意义

姚丽峰　白莉

[摘要] 目的 研究扁平苔藓皮损中白介素-17（IL-17）、叉头转录因子3（FoxP3）和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）的表达及意义。 方法 采用免疫组织化学法和原位末端标记技术检测30例扁平苔藓患者皮损和30例健康人皮肤组织中IL-17、FoxP3、Caspase-3的表达和细胞凋亡情况。 结果 扁平苔藓组IL-17、FoxP3和Caspase-3的积分光密度值分别为（14.67±1.79）×103、（14.52±2.56）×103和（11.82±2.09）×103，明显高于健康对照组，差异有统计学意义（t=18.88、14.69、12.43，P<0.01）。扁平苔藓组的凋亡指数为（70.55±5.78），明显高于健康对照组的（30.01±3.97），差异有统计学意义（t=31.67，P<0.01）。扁平苔藓组IL-17与FoxP3呈正相关，FoxP3与Caspase-3呈正相关，FoxP3和Caspase-3与角质形成细胞凋亡程度呈正相关。 结论 IL-17、FoxP3在扁平苔藓皮损中表达上调，可能导致T细胞免疫功能紊乱，且FoxP3、Caspase-3可能参与了角质形成细胞的凋亡。

[关键词] 扁平苔藓；白介素-17；叉头转录因子3；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3

[中图分类号] R758.65 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2014）02（b）-0025-03

扁平苔藓（lichen planus，LP）是一种多因素相互作用的慢性炎性丘疹鳞屑性疾病。近年来，研究认为LP发病主要与T细胞介导的免疫紊乱和细胞凋亡密切相关[1-3]。IL-17是Th17最具特征性的细胞因子，在许多炎症反应、自身免疫反应中发挥重要作用。FoxP3是调节性T细胞（regulatory T cell，Treg）内的标志性因子，可通过调节Treg细胞的发育和功能，发挥免疫抑制作用。Caspase级联反应在细胞凋亡过程中发挥重要的介导作用，其中Caspase-3最具代表性。本文通过LP皮损中IL-17、FoxP3、Caspase-3的表达情况以探讨其在LP发病中的作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2012年1月～2013年3月本院皮肤科30例LP患者的活检标本，男12例，女18例，年龄18～71岁，平均45.1岁，病程20 d～6个月，取材部位为躯干和四肢，其中6例伴口腔黏膜白斑，所有病例均经临床和病理确诊，同时6个月内均未使用过糖皮质激素、免疫调节剂类药物；健康对照组30例，取自同期本院整形科健康人皮肤，男9例，女21例，年龄21～60岁，平均40.3 岁。所有组织制成石蜡标本备用。本实验经过医学伦理委员会批准，受试者均签署知情同意书。两组的性别和年龄比较差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。

1.2 试剂

兔抗人IL-17、FoxP3、Caspase-3多克隆抗体购自北京博奥森生物技术有限公司；二步法PV6001免疫组织化学检测试剂盒、二氨基联苯胺（DAB）显色剂，原位末端标记技术（TUNEL）试剂盒等均购自北京中杉生物技术有限公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫组织化学法 石蜡切片脱蜡至水化；3% H2O2溶液孵育15 min灭活内源性过氧化物酶；用枸橼酸钠高温高压热修复；滴加IL-17多抗（1∶150）4℃过夜、FoxP3多抗（1∶250）37℃孵育90 min和Caspase-3多抗（1∶200）4℃过夜，分别滴加二步法PV6001，DAB显色，苏木素复染，脱水封片。用磷酸盐缓冲液（PBS）代替一抗作阴性对照。

1.3.2 TUNEL法 石蜡切片脱蜡水化；3% H2O2、甲醇溶液处理；20 ？滋g/ml蛋白酶K 37℃修复15 min；加TUNEL反应液37℃孵育75 min，再加转换剂过氧化物酶37℃孵育30 min，DAB显色，苏木素复染，封片。用不含TdT酶，只含标记dUTP的溶液代替TUNEL反应液作阴性对照。

1.3.3 结果判定 免疫组织化学法检测以细胞质和（或）细胞核有棕黄色颗粒为阳性，采用MIAS-2000图像分析系统，每张切片随机选取5个视野，分析阳性区域积分光密度（IOD）值的强度。TUNEL检测结果以细胞核有棕黄色颗粒为凋亡细胞，每张切片随机选取5个高倍视野（×400），记录阳性细胞数与总细胞数的比例，即为凋亡指数。

1.4 统计学处理

采用SPSS 16.0统计软件对数据进行分析和处理，计量资料以x±s表示，采用t检验，相关性采用Pearson相关分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组免疫组织化学法检测结果的比较

IL-17阳性染色定位于胞质，FoxP3阳性染色定位于胞核，Caspase-3阳性染色定位于胞质或胞核；LP组IL-17、FoxP3阳性细胞主要是真皮浅层淋巴细胞，Caspase-3阳性染色主要位于表皮基底层和棘层的角质形成细胞及真皮浅层淋巴细胞；健康对照组三者仅在部分标本的真皮浅层呈弱阳性表达。两组IL-17、FoxP3及Caspase-3的IOD值比较差异有统计学意义（P<0.01）（表1）。

表1 两组IL-17、FoxP3及Caspase-3 IOD值的比较（×103，x±s）

2.2 两组TUNEL检测结果的比较

LP组表皮的棘层和基底层可见大多数角质形成细胞核被染为棕黄色，尤以液化变性的基底层细胞为多，真皮浅层少量淋巴细胞也呈阳性染色；健康对照组中仅颗粒层有少量的阳性染色。LP组的细胞凋亡指数为（70.55±5.78），健康对照组的细胞凋亡指数为（30.01±3.97），两组比较差异有统计学意义（P<0.05）。

2.3 相关性分析结果

LP组IL-17与FoxP3呈正相关（r=0.60），FoxP3与Caspase-3呈正相关（r=0.61），且FoxP3和Caspase-3与角质形成细胞凋亡程度呈正相关（r=0.74、0.76，P<0.01）。

3 讨论

LP的特征性病理变化为基底层细胞液化变性和真皮上部淋巴细胞浸润。一般认为LP中活化的T细胞聚集到真、表皮连接处，可导致免疫炎症反应和基底层角质形成细胞凋亡[4-5]。本研究发现，LP组IL-17、FoxP3表达高于健康对照组，且两者呈正相关，说明在LP皮损中存在IL-17/FoxP3失衡，两者共同参与LP的炎症反应。IL-17在组织中表达增高与Shaker等[6]的研究结果一致，不同的是有文献报道，LP患者外周血中Treg细胞数量较正常人明显减少，FoxP3表达下降[7-8]。FoxP3在皮损处表达上调可能与某些因素引起FoxP3的过度激活或某种细胞因子趋化Treg细胞的聚集有关。IL-17是T细胞诱导炎症反应的早期启动因素，当与其细胞表面的受体IL-17R结合，通过活化接头蛋白1、TRAF6、NF-κB等一系列信号传导因子，协同肿瘤坏死因子可诱导炎症相关基因的表达，从而使转录编码的IL-6、IL-8等促炎因子大量释放，引起炎症反应，可能是LP表现为慢性炎症反应的重要原因。在炎症反应时，IL-6、TGF-β等又可激活STAT3通路活化ROR-γt（Th17型细胞的特异性转录因子），使Th0细胞向Th17细胞方向分化，进一步加重炎症反应，此外，IL-17可促进B细胞的增殖和分化，协同参与LP的发病[9-11]，Th17和IL-17可能通过上述机制参与LP的发病，也可能是IL-17高表达的原因。

de Boer等[12]的研究发现，在皮肤组织中，FoxP3+T细胞几乎全部只表达CD4与CD25，证实了FoxP3是原位识别CD4+CD25+Treg细胞的特征性标记。本研究中FoxP3表达较健康对照组高，可能是Treg对组织损伤的相关信号反应，通过发挥免疫抑制作用，以减轻损伤程度，达到对机体保护的作用，但由于其抑制机体免疫应答，或许反而延长了慢性炎症的病程。FoxP3+T细胞可通过释放颗粒酶穿孔素激活表达由外来或自身抗原角质形成细胞内的Caspase级联反应的细胞凋亡程序直接杀伤免疫效应细胞[13]，其中Caspase-3是凋亡反应中重要的介导因子，常作为判定凋亡的指标[14]。本研究显示，FoxP3和Caspase-3表达上调与角质形成细胞凋亡程度呈正相关，提示在LP皮损中，FoxP3+T细胞通过激活凋亡程序，诱导角质形成细胞凋亡，以对抗角质形成细胞不断增生，从而缓解颗粒层和棘层的增厚程度。

综上所述，LP患者皮损处IL-17、FoxP3、Caspase-3均高表达，提示IL-17、FoxP3介导的炎症反应和FoxP3、Caspase-3诱导的细胞凋亡可能是LP发生的关键性因素，进一步明确其在LP发病机制中的具体作用并针对性地进行干预，可为临床治疗LP提供新的思路。

[参考文献]

[1] Chatila TA.Role of regulatory T cells in human diseases[J].J Allergy Clin Immunol，2005，116（5）：949-959.

[2] Tesmer LA，Lundy SK，Sarkar S，et al.Th17 cells in human disease[J].Immunol Rev，2008，223：87-113.

[3] 马蕾，李晓红，张玉杰，等.过敏性紫癜患者外周血Th17/Treg细胞平衡性检测[J].中华皮肤科杂志，2010，43（9）：617-619.

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[5] 陈谦明，曾昕.口腔扁平苔藓的病因和发病机制的现状及对策[J].中华口腔医学杂志，2012，47（7）：385-390.

[6] Shaker O，Hassan AS.Possible role of interleukin-17 in the pathogenesis of lichen planus[J].Br J Dermatol，2012， 166（6）：1367-1368.

[7] Tao XA，Xia J，Chen XB，et al.FOXP3 T regulatory cells in lesions of oral lichen planus correlated with disease activity[J].Oral Dis，2010，16（1）：76-82.

[8] 黄远忠，董正蓉，林伯盛，等.扁平苔藓患者外周血CD4+CD25+Treg细胞的检测[J].中国麻风皮肤病杂志，2011， 27（3）：151-153.

[9] Miossec P，Kolls JK.Targeting IL-17 and TH17 cells in chronic inflammation [J].Nat Rev Drug Discov，2012，11（10）：763-776.

[10] Mitsdoerffer M，Lee Y，J？覿ger A，et al.Proinflammatory T helper type 17 cells are effective B-cell helpers[J].Proc Natl Acad Sci USA，2010，107（32）：14292-14297.

[11] Fukushi S，Yamasaki K，Aiba S.Nuclear localization of activated STAT6 and STAT3 in epidermis of prurigo nodularis[J].Br J Dermatol，2011，165（5）：990-996.

[12] de Boer OJ，van der Loos CM，Teeling P，et al.Immunohistochemical analysis of regulatory T cell markers FOXP3 and GITR on CD4+CD25+T cells in normal skin and inflammatory dermatoses[J].J Histochem Cytochem，2007， 55（9）：891-898

[13] 张玉丽，张春敏.CD4+CD25+Treg细胞和Th17细胞与寻常型银屑病发病的相关性[J].中国麻风皮肤病杂志，2011， 27（10）：703-705.

[14] 王娟，白莉，鲍海平，等.扁平苔藓皮损中肿瘤坏死因子α和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶8、3的表达[J].中华皮肤科杂志，2012，45（12）：862-864.

（收稿日期：2013-12-10 本文编辑：李亚聪）

2.3 相关性分析结果

LP组IL-17与FoxP3呈正相关（r=0.60），FoxP3与Caspase-3呈正相关（r=0.61），且FoxP3和Caspase-3与角质形成细胞凋亡程度呈正相关（r=0.74、0.76，P<0.01）。

3 讨论

LP的特征性病理变化为基底层细胞液化变性和真皮上部淋巴细胞浸润。一般认为LP中活化的T细胞聚集到真、表皮连接处，可导致免疫炎症反应和基底层角质形成细胞凋亡[4-5]。本研究发现，LP组IL-17、FoxP3表达高于健康对照组，且两者呈正相关，说明在LP皮损中存在IL-17/FoxP3失衡，两者共同参与LP的炎症反应。IL-17在组织中表达增高与Shaker等[6]的研究结果一致，不同的是有文献报道，LP患者外周血中Treg细胞数量较正常人明显减少，FoxP3表达下降[7-8]。FoxP3在皮损处表达上调可能与某些因素引起FoxP3的过度激活或某种细胞因子趋化Treg细胞的聚集有关。IL-17是T细胞诱导炎症反应的早期启动因素，当与其细胞表面的受体IL-17R结合，通过活化接头蛋白1、TRAF6、NF-κB等一系列信号传导因子，协同肿瘤坏死因子可诱导炎症相关基因的表达，从而使转录编码的IL-6、IL-8等促炎因子大量释放，引起炎症反应，可能是LP表现为慢性炎症反应的重要原因。在炎症反应时，IL-6、TGF-β等又可激活STAT3通路活化ROR-γt（Th17型细胞的特异性转录因子），使Th0细胞向Th17细胞方向分化，进一步加重炎症反应，此外，IL-17可促进B细胞的增殖和分化，协同参与LP的发病[9-11]，Th17和IL-17可能通过上述机制参与LP的发病，也可能是IL-17高表达的原因。

de Boer等[12]的研究发现，在皮肤组织中，FoxP3+T细胞几乎全部只表达CD4与CD25，证实了FoxP3是原位识别CD4+CD25+Treg细胞的特征性标记。本研究中FoxP3表达较健康对照组高，可能是Treg对组织损伤的相关信号反应，通过发挥免疫抑制作用，以减轻损伤程度，达到对机体保护的作用，但由于其抑制机体免疫应答，或许反而延长了慢性炎症的病程。FoxP3+T细胞可通过释放颗粒酶穿孔素激活表达由外来或自身抗原角质形成细胞内的Caspase级联反应的细胞凋亡程序直接杀伤免疫效应细胞[13]，其中Caspase-3是凋亡反应中重要的介导因子，常作为判定凋亡的指标[14]。本研究显示，FoxP3和Caspase-3表达上调与角质形成细胞凋亡程度呈正相关，提示在LP皮损中，FoxP3+T细胞通过激活凋亡程序，诱导角质形成细胞凋亡，以对抗角质形成细胞不断增生，从而缓解颗粒层和棘层的增厚程度。

综上所述，LP患者皮损处IL-17、FoxP3、Caspase-3均高表达，提示IL-17、FoxP3介导的炎症反应和FoxP3、Caspase-3诱导的细胞凋亡可能是LP发生的关键性因素，进一步明确其在LP发病机制中的具体作用并针对性地进行干预，可为临床治疗LP提供新的思路。

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[12] de Boer OJ，van der Loos CM，Teeling P，et al.Immunohistochemical analysis of regulatory T cell markers FOXP3 and GITR on CD4+CD25+T cells in normal skin and inflammatory dermatoses[J].J Histochem Cytochem，2007， 55（9）：891-898

[13] 张玉丽，张春敏.CD4+CD25+Treg细胞和Th17细胞与寻常型银屑病发病的相关性[J].中国麻风皮肤病杂志，2011， 27（10）：703-705.

[14] 王娟，白莉，鲍海平，等.扁平苔藓皮损中肿瘤坏死因子α和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶8、3的表达[J].中华皮肤科杂志，2012，45（12）：862-864.

（收稿日期：2013-12-10 本文编辑：李亚聪）

2.3 相关性分析结果

LP组IL-17与FoxP3呈正相关（r=0.60），FoxP3与Caspase-3呈正相关（r=0.61），且FoxP3和Caspase-3与角质形成细胞凋亡程度呈正相关（r=0.74、0.76，P<0.01）。

3 讨论

LP的特征性病理变化为基底层细胞液化变性和真皮上部淋巴细胞浸润。一般认为LP中活化的T细胞聚集到真、表皮连接处，可导致免疫炎症反应和基底层角质形成细胞凋亡[4-5]。本研究发现，LP组IL-17、FoxP3表达高于健康对照组，且两者呈正相关，说明在LP皮损中存在IL-17/FoxP3失衡，两者共同参与LP的炎症反应。IL-17在组织中表达增高与Shaker等[6]的研究结果一致，不同的是有文献报道，LP患者外周血中Treg细胞数量较正常人明显减少，FoxP3表达下降[7-8]。FoxP3在皮损处表达上调可能与某些因素引起FoxP3的过度激活或某种细胞因子趋化Treg细胞的聚集有关。IL-17是T细胞诱导炎症反应的早期启动因素，当与其细胞表面的受体IL-17R结合，通过活化接头蛋白1、TRAF6、NF-κB等一系列信号传导因子，协同肿瘤坏死因子可诱导炎症相关基因的表达，从而使转录编码的IL-6、IL-8等促炎因子大量释放，引起炎症反应，可能是LP表现为慢性炎症反应的重要原因。在炎症反应时，IL-6、TGF-β等又可激活STAT3通路活化ROR-γt（Th17型细胞的特异性转录因子），使Th0细胞向Th17细胞方向分化，进一步加重炎症反应，此外，IL-17可促进B细胞的增殖和分化，协同参与LP的发病[9-11]，Th17和IL-17可能通过上述机制参与LP的发病，也可能是IL-17高表达的原因。

de Boer等[12]的研究发现，在皮肤组织中，FoxP3+T细胞几乎全部只表达CD4与CD25，证实了FoxP3是原位识别CD4+CD25+Treg细胞的特征性标记。本研究中FoxP3表达较健康对照组高，可能是Treg对组织损伤的相关信号反应，通过发挥免疫抑制作用，以减轻损伤程度，达到对机体保护的作用，但由于其抑制机体免疫应答，或许反而延长了慢性炎症的病程。FoxP3+T细胞可通过释放颗粒酶穿孔素激活表达由外来或自身抗原角质形成细胞内的Caspase级联反应的细胞凋亡程序直接杀伤免疫效应细胞[13]，其中Caspase-3是凋亡反应中重要的介导因子，常作为判定凋亡的指标[14]。本研究显示，FoxP3和Caspase-3表达上调与角质形成细胞凋亡程度呈正相关，提示在LP皮损中，FoxP3+T细胞通过激活凋亡程序，诱导角质形成细胞凋亡，以对抗角质形成细胞不断增生，从而缓解颗粒层和棘层的增厚程度。

综上所述，LP患者皮损处IL-17、FoxP3、Caspase-3均高表达，提示IL-17、FoxP3介导的炎症反应和FoxP3、Caspase-3诱导的细胞凋亡可能是LP发生的关键性因素，进一步明确其在LP发病机制中的具体作用并针对性地进行干预，可为临床治疗LP提供新的思路。

[参考文献]

[1] Chatila TA.Role of regulatory T cells in human diseases[J].J Allergy Clin Immunol，2005，116（5）：949-959.

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[3] 马蕾，李晓红，张玉杰，等.过敏性紫癜患者外周血Th17/Treg细胞平衡性检测[J].中华皮肤科杂志，2010，43（9）：617-619.

[4] 赵辨.临床皮肤病学[M].南京：江苏科学技术出版社，2010：1037-1045.

[5] 陈谦明，曾昕.口腔扁平苔藓的病因和发病机制的现状及对策[J].中华口腔医学杂志，2012，47（7）：385-390.

[6] Shaker O，Hassan AS.Possible role of interleukin-17 in the pathogenesis of lichen planus[J].Br J Dermatol，2012， 166（6）：1367-1368.

[7] Tao XA，Xia J，Chen XB，et al.FOXP3 T regulatory cells in lesions of oral lichen planus correlated with disease activity[J].Oral Dis，2010，16（1）：76-82.

[8] 黄远忠，董正蓉，林伯盛，等.扁平苔藓患者外周血CD4+CD25+Treg细胞的检测[J].中国麻风皮肤病杂志，2011， 27（3）：151-153.

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[10] Mitsdoerffer M，Lee Y，J？覿ger A，et al.Proinflammatory T helper type 17 cells are effective B-cell helpers[J].Proc Natl Acad Sci USA，2010，107（32）：14292-14297.

[11] Fukushi S，Yamasaki K，Aiba S.Nuclear localization of activated STAT6 and STAT3 in epidermis of prurigo nodularis[J].Br J Dermatol，2011，165（5）：990-996.

[12] de Boer OJ，van der Loos CM，Teeling P，et al.Immunohistochemical analysis of regulatory T cell markers FOXP3 and GITR on CD4+CD25+T cells in normal skin and inflammatory dermatoses[J].J Histochem Cytochem，2007， 55（9）：891-898

[13] 张玉丽，张春敏.CD4+CD25+Treg细胞和Th17细胞与寻常型银屑病发病的相关性[J].中国麻风皮肤病杂志，2011， 27（10）：703-705.

[14] 王娟，白莉，鲍海平，等.扁平苔藓皮损中肿瘤坏死因子α和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶8、3的表达[J].中华皮肤科杂志，2012，45（12）：862-864.

（收稿日期：2013-12-10 本文编辑：李亚聪）