AG490对胆囊癌细胞JAK2/STAT3信号传导通路的抑制作用研究

傅丽霞　叶斌　施骅　潘俊娣

[摘要] 目的 研究JAK激酶抑制剂AG490对人胆囊癌细胞株GBC-SD生长增殖的影响，探讨AG490对JAK2/STAT3信号传导通路的抑制作用及其对胆囊癌治疗的意义。 方法 培养GBC-SD细胞，根据研究目的设置实验组和对照组，在第一项实验中，实验组以3个浓度梯度的AG490作用于GBC-SD细胞，对照组加入等量PBS，继续培养，24 h后以MTT法测定OD值，反映各组细胞的增殖活性；在第二项实验中，实验组以100 μmol/mol的AG490作用24 h，对照组平行培养，收集两组细胞进行免疫印迹法检测，观察AG490对细胞中JAK2、STAT3蛋白表达的影响。 结果 AG490能有效抑制胆囊癌细胞增殖，且抑制作用呈浓度依赖性，即浓度越高，抑制作用越明显，不同浓度组细胞增殖抑制率差异有统计学意义（P<0.05）；AG490作用后细胞中JAK2、STAT3蛋白浓度降低，与对照组比较差异亦有统计学意义（P<0.05）。 结论 AG490可以抑制细胞中JAK2、STAT3蛋白的表达，通过抑制JAK2/STAT3信号传导通路发挥抑制胆囊癌细胞增殖的作用。

[关键词] 胆囊癌；JAK2；STAT3；抑制增殖

[中图分类号] R735.8 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2016）25-0004-04

Inhibitory effect of AG490 on JAK2/STAT3 signal pathway in gallbladder carcinoma cells

FU Lixia YE Bin SHI Hua PAN Jundi

Lishui Central Hospital in Zhejiang Province， Lishui 323000， China

[Abstract] Objective To study the impact of JAK kinase inhibitor AG490 on the growth of human gallbladder carcinoma cell GBC-SD， and to investigate the inhibitory effect of AG490 on JAK2/STAT3 signaling pathway and its implications for the treatment of gallbladder cancer. Methods GBC-SD cell was cultivated and grouped into testing group and control group according to this project purpose. In the first part， 3 different concentrations of AG490 was used on GBC-SD cells of test group， while the control group was cultured normally PBS， MTT assay was used for testing cell proliferation OD after 24 hours to see its activity of proliferation. On the second part of experiment， the cells in testing group endured 100 μmol/mol of AG490 for 24 hours， after which cells in both groups were collected and handled， later， Western blot was performed to detect the impact of AG490 on the expression level of JAK and STAT3 protein. Results AG490 could inhibit cell proliferation in a concentration-dependent manner， the higher concentration resulted in higher inhibition， namely the inhibition rate of cell proliferation between different concentrations of groups was different， and the difference was statistically significant（P<0.05）. Another founding that JAK2 and STAT3 protein both reduced compared with the control group with statistically significant difference（P<0.05）. Conclusion AG490 can inhibit the proliferation of gallbladder cancer cells by inhibiting the expression of JAK2 and STAT3 protein， and it can interfere the JAK2/STAT3 signal pathway to perform its inhibition effect.

[Key words] Gallbladder carcinoma； JAK2； STAT3； Inhibition proliferation

近年来陆续有研究发现，蛋白质酪氨酸激酶2/信号传导子与激活子3（JAK2/STAT3）信号传导通路的持续激活可致细胞发生异常增殖并导致其向恶性转化，该信号通路活性激活的程度影响人类多种恶性肿瘤的发生与发展，据此推测，研究该信号通路的阻断作用与机制将有利于肿瘤的治疗[1，2]。AG490是一种JAK2/STAT3的特异性信号转导阻滞剂，被认为能影响癌细胞的生物学活性，能够抑制细胞增殖，降低肿瘤细胞的侵袭力，控制肿瘤生长等[3-5]。目前已有研究发现胆囊癌组织中STAT3蛋白的表达水平上调，可能是引起肿瘤恶化、转移的重要原因[6]，但关于AG490通过抑制胆囊癌细胞的JAK2/STAT3信号通路从而对胆囊癌发挥抑制作用研究尚少。本研究将AG490作用于人胆囊癌细胞株GBC-SD细胞，观察AG490对JAK2/STAT3信号传导通路的抑制作用，为进一步的研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

人胆囊癌细胞株GBC-SD购自ATCC，胎牛血清为杭州四季青生物工程有限公司产品，DEME（dulbeccos modified eagle medium）细胞培养基购自GIBCO，JAK抑制剂 AG490（CALBIOCHEM），人类单克隆JAK2、STAT3抗体购自Abcam 公司，蛋白定量试剂盒购自Sigma，实验所需抗体购自Abcam，其他试剂为国产分析纯。

1.2 实验方法

1.2.1 AG490对细胞增殖活性影响研究 培养胆囊癌细胞株GBC-SD，在其生长状态良好的情况下将其分为4组，即分别加入3个浓度AG490（10 μmol/mol、50 μmol/mol、100 μmol/mol）的实验组（即AG490作用组）及加入等量磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS）的对照组，作用24 h后，用3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐[3-（4，5-dimethyl-2-thiazolyl）-2，5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT]检测各组细胞增殖状况。MTT操作过程为：（1）用胰酶消化对数生长期的细胞，见细胞脱壁后终止消化，离心收集细胞并转移到含有血清的培养基中，轻轻吹打混匀制成细胞悬液，用台盼蓝进行细胞计数后，调整细胞的密度至（5～10）×104/mL。（2）将细胞悬液制备好后，在加入96孔板之前再次轻轻混匀，每孔加入90 μL，使所用的GBC-SD细胞的生长密度为5000～10000/孔，位于边缘的孔用无菌PBS填充。（3）将接种好的细胞培养板放入培养箱中培养，至细胞单层铺满96孔平底板的孔底，实验组加入预先配置好的不同浓度的AG490，每个浓度做6个复孔，对照组细胞加入等量PBS。原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但常在前1 d下午铺板，次日上午加药，每孔10 μL，设3～6个复孔。本研究根据实验设计设置了3个浓度梯度及未加药物的对照组。（4）继续培养：放置在5%CO2、37℃的细胞培养箱中孵育16～48 h，通过倒置显微镜观察药物对细胞的作用效果，当发现细胞发生明显的形态变化，在高浓度组可见死亡细胞时，作为培养终点，本实验以加入AG490后24 h作为观察点。（5）每孔加入10 μL MTT溶液（5 mg/mL，即0.5%MTT），放入培养箱中继续培养4 h。（6）终止培养，在各孔细胞中加入二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）溶解结晶。每孔加入150 μL DMSO，手动震荡或将培养板置于摇床上低速振荡10 min左右，待紫色的结晶物充分溶解后，通过酶联免疫检测仪在OD 492 nm处测量各孔的吸光值。（7）以OD值来反映细胞增殖活性。

1.2.2 AG490对细胞中JAK2、STAT3蛋白表达水平的影响研究 细胞株选择及培养同上。根据是否进行干预分为AG490作用组和对照组，实验组加入100 μmol/mL的AG490，作用24 h后分别收集两组GBC-SD细胞并进行预处理，测定蛋白含量，继而进行细胞免疫印迹（western blot，WB）分析，对两组细胞表达的蛋白进行定量比较[7]，操作步骤依次为：（1）蛋白样品准备；（2）进行SDS-聚丙烯酸胺凝胶电泳；（3）湿盒-半干法转膜：（4）免疫反应；（5）底物反应、显影及定影；（6）成像，将胶片扫描或拍照，用凝胶图像处理系统分析目标蛋白条带的分子量和净光密度值。

1.3 观察指标

细胞经AG490作用后以MTT测定OD值、细胞中JAK2、STAT3蛋白的表达水平。

1.4 统计学分析

采用SPSS16.0进行数据录入与分析，不同浓度组别细胞吸光度值为计量资料，组间比较采用单因素方差分析，两组蛋白浓度也为计量资料，两组之间比较采用成组t检验，α=0.05，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 AG490 对 GBC-SD 细胞增殖的影响

通过测定的OD值，可以间接反映细胞的增殖抑制情况，OD值越小，表明存活或增殖的细胞越少，即药物或待测组分对细胞的抑制作用越强。本研究结果中，AG490的浓度越高，OD值越小，说明AG490可呈浓度依赖性抑制 GBC-SD细胞增殖，即AG490浓度越高， 其对 GBC-SD 细胞的增殖抑制作用越明显。

2.2 STAT3、STAT3 蛋白表达

GBC-SD 细胞中加入AG490后，通过蛋白定量分析比较，发现JAK2、STAT3蛋白的表达水平均明显低于各自对照组细胞中的蛋白表达量，AG490作用组两种蛋白的表达量与对照组比较，差异均有统计学意义（P<0.05），见表 2。可见，AG490作用后，抑制了两种蛋白的表达，从而可下调JAK2/STAT3信号通路的转导活性，抑制肿瘤细胞增殖。

3 讨论

蛋白质酪氨酸激酶（janus kinase，JAK）是一类非跨膜型的酪氨酸激酶，它既能磷酸化与其相结合的细胞因子受体，又能磷酸化多个含特定SH2结构域的信号分子。STAT即信号传导与转录激活因子（signal transducer and activator of transcription，STAT）蛋白家族是能够被不同的细胞因子受体激活的一组相关蛋白，它们在细胞因子-受体发生相互作用时充当载体，发挥保证信号在细胞内部传递的内在特异性作用。在已有研究所揭晓的STAT蛋白当中，STAT3由于被发现与肿瘤发生发展的关系较为密切，因此越来越受到研究者们的重视[7-9]。Jia L等[10]发现，STAT3在胆囊癌中呈现较高水平的表达。而诸多研究已证实，STAT3通过信号传导的方式参与调节了正常细胞的生存、增殖、血管生成、免疫应答、凋亡等过程[2，10，11]。

JAK-STAT信号通路是近年来发现的一条由细胞因子刺激的信号转导通路，参与细胞的增殖、分化、凋亡以及免疫调节等许多重要的生物学过程，与其他的信号通路比较，此条信号通路的传递过程相对简单，主要包括三个组分，即酪氨酸激酶相关受体、酪氨酸激酶JAK以及转录因子STAT。JAK-STAT通路的过度激活却会导致正常细胞向恶性转化，该因子通过调控下游靶基因的表达促进肿瘤细胞的生长和抑制肿瘤细胞凋亡，应用JAK/STAT抑制剂可有效抑制肿瘤细胞的生长[12-14]。

AG490是JAK2的特异性拮抗剂，为PTK抑制物之一，许多报道在体外试验中开展AG490对JAK2的信号转导及调控作用的研究[6，15]。作为JAK2/STAT3的信号通路特异性信号转导阻滞剂，其作用机制是抑制JAK2的磷酸化，进而抑制JAK2底物STAT3的磷酸化（以酪氨酸蛋白激酶的形式活化），从而阻滞细胞信号的传导。基于此，研究者们倾向于将JAK2/STAT3信号传导通路阻滞剂AG490作为研究恶性肿瘤靶向治疗的一个重要方向。诸多研究发现JAK2激酶抑制剂AG490以下调STAT3下游基因的表达的方式来抑制肿瘤细胞的生长及转移[16，17]。

基于上述理论与实践，加之已有研究证明STAT3在胆囊癌等多种癌组织中高表达[18-21]，但将JAK2/STAT3信号通路应用于胆囊癌研究未见系统报道。本研究在充分考虑到可行性的前提下开展胆囊癌细胞JAK2/STAT3信号传导通路的抑制作用研究，探讨JAK2/STAT3信号对抑制胆囊癌的关联及应用前景。实验结果表明，JAK2/STAT3与胆囊癌的发生发展存在关联，应用JAK2/STAT3抑制剂能有效抑制癌细胞增殖。应用阻滞剂AG490后，胆囊癌细胞GBC-SD中JAK2和STAT3的蛋白表达量均较正常对照组下降，可以认为AG490抑制了这两种蛋白的表达。另一方面，AG490 作用后，GBC-SD细胞的生长与增殖活性受到抑制，且这种抑制作用呈现剂量依赖性，即AG490作用于细胞的浓度越高，细胞的增殖活性抑制率就越高。本研究提示，JAK2/STAT3与胆囊癌的发生、发展存在密切联系，对JAK2/STAT3抑制剂的进一步研究及应用将有助于胆囊癌的治疗。

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（收稿日期：2016-04-26）