消化道肿瘤淋巴结转移灶P53、bcl—2、survivin与化疗药敏性的关系研究

陈希++赵建华

[摘要] 目的 研究消化道肿瘤淋巴结转移灶P53、bcl-2、survivin与化疗药敏性的关系。 方法 选择62例消化道恶性肿瘤患者的原发灶及转移淋巴结的肿瘤组织，进行四氮唑盐（MTT）法原代细胞培养体外化疗药敏性实验，对肿瘤细胞对顺铂（DDP）、长春新碱（VCR）、紫杉醇（PTX）、甲氨蝶吟（MTX）4种常用化疗药物的体外化疗药敏性进行检测，并采用免疫组织化学法（SP）对原发灶及转移灶中的P53、bcl-2、survivin的表达进行检测。 结果 P53与bcl-2在原发灶和转移灶间的表达呈显著相关性（P<0.05），而survivin无显著相关性（P>0.05）。DDP、VCR、MTX对转移灶的肿瘤细胞抑制率显著低于原发灶（P<0.05），而PTX在原发灶与转移灶对肿瘤细胞的抑制情况无显著差异（P>0.05）；原发灶中的化疗药物抑制率均与P53、bcl-2、survivin不相关（P>0.05）；而在淋巴结转移灶中，P53与DDP对肿瘤细胞的抑制率呈负相关（P<0.05），survivin及bcl-2均与PTX抑制率呈负相关（P<0.05）。 结论 消化道肿瘤淋巴结转移灶中P53、bcl-2、survivin的表达情况及化疗药敏性均体现出异质性，术后化疗应尽量避免化疗靶目标的偏差，以提升癌症综合治疗的效果。

[关键词] 消化道肿瘤；淋巴结；凋亡抑制蛋白；化疗药敏性

[中图分类号] R735 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2016）25-0012-03

Research of relationship between expression of P53， bcl-2， survivin and chemosensitivity in lymph node metastases of gastrointestinal tumors

CHEN Xi ZHAO Jianhua

Department of Oncology， the First Peoples Hospital of Jingdezhen City in Jiangxi Province， Jingdezhen 333000， China

[Abstract] Objective To explore the relationship between expression of P53， bcl-2， survivin and chemosensitivity in lymph node metastases of gastrointestinal tumors. Methods The tumor tissue and metastasis lymph nodes of 62 patients with gastrointestinal tumors were collected， and the tumor cells chemosensitivity to DDP， VCR， PTX， MTX were detected by MTT assay，meanwhile the expression of P53， bcl-2 and survivin in primary tumors and lymph node metastases were detected by immunohistochemically. Results The expression of P53 and bcl-2 in primary tumors and lymph node metastases were significant correlation（P<0.05），while survivin were not（P>0.05）. The inhibition of tumor cells of DDP， VCR， MTX in lymph node metastases were significantly lower than those in primary tumors（P<0.05）， while PTX were not（P>0.05）. There were no correlation between expression of P53， bcl-2， survivin and inhibition rate of tumor cells（P>0.05）， but in lymph node metastases，the expression of P53 was negative correlation with inhibition rate of tumor cells for DDP inhibition（P<0.05）， and both of survivin and bcl-2 were negative correlation for PTX（P<0.05）. Conclusion The expression of P53， bcl-2， and survivin chemosensitivity in lymph node metastases of gastrointestinal tumors are different from primary tumors， so it is necessary to avoid the deviation of chemotherapy target postoperative as far as possible to improve the comprehensive curative effect.

[Key words] Gastrointestinal tumors； Lymph node； Apoptosis inhibiting protein； Chemosensitivity

消化系统恶性肿瘤在我国各类系统肿瘤的发病率中占首位，其中胃癌、食管癌、结直肠癌、肝癌的死亡总数占前10位，在恶性肿瘤中的比例占到40.75%[1]。术后辅助化疗是治疗消化道恶性肿瘤的重要手段。研究表明，多数化疗药物抗肿瘤的机制都是通过对凋亡相关基因或肿瘤细胞DNA发挥作用、诱导细胞凋亡来实现的[2，3]。然而化疗药物诱导的肿瘤细胞凋亡却会受凋亡抑制蛋白的抑制作用，产生多药耐药（multi-drug resistance，MDR）表型，从而严重影响化疗的效果。P53是一种重要的凋亡调节基因，bcl-2与survivin是两种新发现的耐药基因蛋白。本研究对消化道肿瘤淋巴结转移灶P53、bcl-2、survivin与化疗药敏性的相关性进行了探讨，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料

选择2015年1月～2016年5月的62例消化道恶性肿瘤并伴淋巴结转移患者，疾病诊断均经手术及病理证实，排除术前放、化疗者。其中男35例，女27例；年龄29～78岁，平均（59.44±4.16）岁；胃癌28例，食管癌17例，大肠癌17例。本研究符合医学伦理要求，且取得所有患者的知情同意。

1.2 肿瘤细胞培养及化疗药敏性实验

采集患者的原发灶及转移淋巴结的肿瘤组织置于双抗培养液中，在2 h内进行四氮唑盐（MTT）法原代细胞培养体外化疗药敏性实验。选用4种常用化疗药物：顺铂（DDP）、长春新碱（VCR）、甲氨蝶吟（MTX）、紫杉醇（PTX），药物终浓度以血浆峰值药物浓度为准，以不加药物的细胞为对照，每种药物均设3个复孔，接种细胞悬液200 μL/孔，振荡混匀后加入5%CO2饱和湿度的培养箱培养48 h，温度控制在37℃，加5 g/L噻唑蓝（MTT）20 μL/孔再进行3～24 h的培养。终止培养后进行离心处理弃上清，之后加入二甲基亚矾（DMSO）100 μL/孔，混匀后使用酶标仪570 nm对各孔吸光度（A）进行测试。肿瘤细胞生长抑制率（IR）=（1-给药孔A/对照组A）×100%。

1.3免疫组织化学法（SP）测定

采用SP法对原发灶及转移淋巴结的P53、bcl-2、survivin进行测定，严格按试剂盒说明书操作。由深圳市国赛生物技术有限公司提供鼠抗人P53、bcl-2、survivin单克隆抗体及免疫组织化学染色试剂盒。用已知阳性切片作阳性对照，用磷酸盐缓冲液（PBS）代替一抗作阴性对照。每张切片取5个高倍视野，各计数100个细胞，P53染色阳性表现为胞核着黄色，bcl-2与survivin均为胞膜和（或）胞质着黄色。着色强度计分标准与阳性细胞率计分标准参考李勇[4]的研究，根据二者的积分乘积判断阴阳性，即乘积=1为（-）；乘积2～3为（+）；乘积4～7为（++）；乘积≥8为（+++）。

1.4 统计学方法

采用SPSS18.0统计学软件进行数据处理，计量资料以（x±s）表示，比较采用配对t检验及直线相关分析，等级资料采用Wilcoxon配对秩和检验与Spearman等级相关分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1 原发灶和淋巴结转移灶的P53、bcl-2、survivin表达情况

P53在原发灶和淋巴结转移灶中的表达一致率为68.04%（36/62），survivin为25.81%（16/62），bcl-2为43.55%（27/62）；P53与bcl-2的表达一致率较高，而survivin较低。三者在原发灶和淋巴结转移灶中的表达强度无显著差异（P>0.05）。P53与bcl-2在原发灶和淋巴结转移灶间的表达呈显著相关性（P<0.05），而survivin无显著相关性（P>0.05）。

2.2 4种化疗药物对原发灶和淋巴结转移灶的肿瘤细胞抑制率比较

PTX对原发灶和淋巴结转移灶的肿瘤细胞抑制率无明显差异（P>0.05），但DDP、VCR、MTX对淋巴结转移灶肿瘤细胞抑制率显著低于原发灶（P<0.05）。直线相关分析显示，MTX对原发灶和淋巴结转移灶的肿瘤细胞抑制率呈正相关性。

2.3原发灶和淋巴结转移灶P53、bcl-2、survivin表达与化疗药物抑制率的关系

原发灶中的P53、bcl-2、survivin均与化疗药物抑制率无明显相关性（P>0.05）。而在淋巴结转移灶中，P53与DDP对肿瘤细胞的抑制率呈负相关（r=-0.426，P<0.05）；survivin及bcl-2均与PTX抑制率呈负相关（r=-0.399，r=-0.483，P<0.05）。

3讨论

淋巴结转移是影响恶性肿瘤预后的独立危险因素[5]，消化系统恶性肿瘤发生淋巴结转移的比例达到60%～80%[6，7]。在肿瘤进展过程中，亚克隆细胞群的侵袭能力、化疗药敏性等部分细胞学特性可能会发生异质变化。肿瘤的MDR与不同信号转导通路协调的级联样网络式调节机制及多种基因/蛋白的表达有密切联系[8]，其呈现的明显异质性变化涉及到肿瘤进展过程中不同细胞亚群发生的基因及大分子改变[9]，但目前国内尚缺乏有关消化道肿瘤转移灶凋亡抑制蛋白的表达与化疗耐药性的关系的研究报道。

P53、bcl-2及survivin是三种具有细胞凋亡调节功能的凋亡抑制蛋白，也是与消化道肿瘤耐药相关的因子之一。本研究显示，P53与bcl-2在原发灶和淋巴结转移灶中的表达一致率较高，而survivin较低，提示消化道肿瘤淋巴结转移灶凋亡抑制蛋白的表达发生了异质性变化；4种常用化疗药物对原发灶与转移灶肿瘤细胞的抑制率有明显差异，提示转移灶的化疗药敏性也具有异质性。

目前认为，MDR形成机制至少包括两个途径，其一为经典耐药途径，其二为化疗药物作用于肿瘤细胞后产生的凋亡抵抗[10，11]。化疗药物可对肿瘤细胞DNA构成破坏，细胞可通过P53通路反式激活P21WAF/CIP1基因程序而诱导细胞凋亡，与野生型P53不同，突变型P53不具有对bcl-2及survivin负反馈调节作用[12]；bcl-2可通过影响自扰细胞色素线粒体正常释放而干扰蛋白酶级联反应激活，是最终凋亡调控点；而survivin可通过直接抑制caspase阻断细胞凋亡。故化疗药物作用于靶点时，bcl-2与survivin这两种抗凋亡蛋白可对化疗药物诱导的肿瘤细胞凋亡产生抑制作用，从而出现MDR表型[13，14]。

相关性分析提示原发灶中的P53、bcl-2、survivin均与化疗药物抑制率无明显相关性，而在淋巴结转移灶中却与不同化疗药物的抑制率呈负相关，提示转移灶与原发灶具有MDR异质性，主要耐药相关因子不同而使化疗药物的抑制率有所差异，这可能与肿瘤细胞对化疗药物的MDR是涉及多种基因/蛋白共同参与、机制复杂的多环节网络化调节有关。孙延霞[15]研究指出，肿瘤组织耐药相关因子表达与某种化疗药物对肿瘤细胞的抑制率表现出负相关的关系，说明该耐药相关因子高表达时对某种药物敏感性下降表现出相对化疗耐药。

综上所述，消化道肿瘤淋巴结转移灶中P53、bcl-2、survivin的表达情况及化疗药敏性均体现出异质性，提示术后化疗应尽量避免化疗靶目标的偏差，以提升癌症综合治疗的效果。

[参考文献]

[1] 赵建辉，檀碧波，吴胜春，等. 5-FU对结肠癌转移灶抑制率与耐药相关因子表达关系的实验研究[J]. 中国普通外科杂志，2010，19（4）：355-358.

[2] 吕品田，檀碧波，刘斌，等. 胃癌淋巴结转移灶对顺铂体外化疗的药敏性及多种耐药相关因子的表达[J]. 郑州大学学报（医学版），2010，4（24）：566-569.

[3] 韩杰，赵建辉，檀碧波，等. 消化道肿瘤凋亡抑制蛋白表达与体外化疗药物敏感性的关系[J]. 中华普通外科杂志，2011，24（2）：149-152.

[4] 李勇，檀碧波，赵群，等. COX-2和凋亡抑制蛋白在老年胃癌患者原发灶与转移淋巴结中的表达差异[J]. 中国普通外科杂志，2012，21（4）：411-414.

[5] 丛德刚，王胜发. 非小细胞肺癌中survivin基因表达及其与p53基因表达的相互关系[J]. 肿瘤防治研究，2013， 32（12）：758-760.

[6] 王安峰. 消化道肿瘤转移淋巴结凋亡抑制蛋白表达与化疗药敏性的关系[J]. 河北医科大学学报，2010，2（26）：143-146.

[7] 石晓明. 结肠癌转移淋巴结P-gp表达与体外化疗敏感性的关系[J]. 中国老年学杂志，2011，11（14）：1949-1951.

[8] 徐元兵. 癌胚抗原的测定在结直肠癌及其转移诊疗中的进展[J]. 中国癌症防治杂志，2013，1（31）：73-75.

[9] 李勇，檀碧波，范立侨，等. 胃癌转移淋巴结多种耐药相关因子表达与多西紫杉醇药敏性的关系[J]. 中华实验外科杂志，2010，27（4）：431-432.

[10] 马瑞忠，刘洪明. 消化道肿瘤腹膜后淋巴结转移的治疗进展[J]. 中国医药指南，2012，17（14）：78-81.

[11] 李勇，檀碧波，赵群，等. 老年胃癌原发灶与淋巴结转移灶体外化疗药敏性的差异及意义[J]. 实用肿瘤杂志，2012，2（33）：116-119.

[12] 韩杰，檀碧波，耿玮，等. 消化道肿瘤组织中 P- gp与体外化疗药敏性的关系及其意义[J]. 癌症，2013，27（11）：1166-1171.

[13] 檀碧波，韩杰，吕炳蓉，等. 消化道肿瘤原发灶、淋巴结转移灶中 p53、表达及意义[J]. 山东医药，2012，47（21）：83.

[14] 常方方. 奥沙利铂联合顺铂对体外培养BGC- 823 细胞增殖的影响[J]. 郑州大学学报：医学版，2014，44（2）：359.

[15] 孙延霞，杨绍娟，高申，等. siRNA 沉默 survivin 对人胃癌 SGC7901 细胞生长的抑制作用[J]. 吉林大学学报（医学版），2008， 34（3）：477-481.

（收稿日期：2016-06-22）