基因修饰小鼠的骨性关节炎模型研究进展

蔡大卫 蒋青

骨性关节炎（OA）的模型动物有很多，但长期以来可做基因修饰（基因敲除、基因表达及基因转染）的动物只有小鼠，虽然已有大鼠敲除的相关报道，但尚不成熟。

基因修饰（GM）小鼠，以敲出小鼠为例，越来越多应用于骨性关节炎的分子机制研究和治疗靶点寻找上，相关文献呈逐年增加的趋势。在PUBMED对2013年文献（至11月）以关键词mouse/mice和osteoarthritis/OA检索，有41篇用到敲除小鼠，其中 10 篇[相关分子：AnxA6，MIP-1 γ，ADAMTS-7，fat-1，Lrp6，RAGE，sirt1，adamts5，mmp13，CB1（2）]对小鼠进行了OA造模。因此，小鼠OA模型因其特殊的价值有整理归纳的必要。

1 模型分类及相关介绍

单独对小鼠OA模型的分类尚缺，本文在造模的操作水平上将已有的小鼠模型（非自发）分为关节腔注射类和手术切断（除）类两种。

1.1 关节腔注射类

1.1.1 注射碘醋酸盐（MIA）诱发OA 将小鼠膝关节弯曲90°以露出关节间隙，用30G针头穿过髌下韧带后注射5～10μl浓度为5mg/ml的MIA溶液进入小鼠膝关节。作用20～30d后可有明显病理和组织化学差异[1]。造模机理是它可以通过抑制软骨细胞中甘油醛-3-磷酸脱氢酶阻断糖酵解过程，继而软骨结构的完整性可因软骨细胞功能不全受损，软骨下骨裸露后可有疼痛和机械高敏性出现。模型可模拟OA发病过程中基质降解现象，有显著关节疼痛出现。其基质降解多累及髌骨中部和内外侧胫骨平台的中部。除了2007年Boileau利用此模型敲除鼠研究galectin-3对OA的作用外，近年来的研究多和OA疼痛（pain）相关，如2013年Carmen使用的CB1、CB2敲除小鼠。

1.1.2 TTR模型 即TGFbeta1注射以及跑步机模型。给小鼠单侧膝关节腔内注射TGFb1（200ng），48h后再注射1次。之后每天以32cm/min的速度进行20min的17°上斜坡强制跑步（跑步机），持续2周。本模型可以通过改变小鼠最终处死的时间获得急慢性不同时相的模型数据[2]。同时，此模型在ADAMTS5、CD44等敲除小鼠上都可比较软骨侵蚀，关节周围纤维化，和滑膜以及半月板的变化。此外，Anna配合此模型进行录像步态分析以比较OA严重程度。

1.1.3 胶原酶（Collagenase）注射 注射细菌胶原酶进入小鼠膝关节腔中，注射量6μl，浓度可为1.0%(w/v)，造模时间7～42天，该模型可于不同时间处死小鼠以观察不同时相OA样改变。模型早期有软骨纤维化和基质降解，后期发展为软骨下骨磨损以及骨赘形成[3]。造模机理：胶原酶可以破坏主要的关节结构如肌腱、韧带、半月板，引起关节不稳定性增加。胶原酶注射模型的骨性关节炎样损害主要表现在关节内侧，但对于大龄小鼠外侧也会累及（也有报道说最受累区域是和注射的位置有关）。此模型的OA样表现不仅限于关节软骨，滑膜和韧带都会累及。

1.1.4 抗原诱导的OA模型（AIA） 在小鼠尾巴基部注射100μg溶于乳化剂中的mBSA，以及100μl Freund佐剂。这样免疫以后的第10天，可在小鼠膝关节腔内注射入10μl含100μg mBSA的溶液。模型在免疫后第17天完成[4]。

1.1.5 木瓜蛋白酶 往小鼠膝关节腔中注入已被L-半胱氨酸激活后的浓度1% (w/v)的木瓜蛋白酶溶液6μL，3周后有显著OA样改变，可累及软骨面、韧带、滑膜，而远期（9周）软骨下骨的硬化改变不是很显著[5]。

1.2 手术切断（除）类主要包括 （1）DMM：切断连接内侧半月板（MM）和胫骨平台的半月板胫骨韧带（MMTL）[6]；（2）ACLT：前交叉韧带（ACT）可以限制胫骨前移动起到稳定关节的作用，本模型就是切断前交叉韧带[7]；（3）内侧副韧带（MCL）切断联合内侧半月板切除[8]；（4）完全或者部分的半月板切除术[9]。

Kamekura[10]通过不同韧带和（或）半月板切断（除）的组合模拟了4种不同严重程度的OA手术模型，分别为：（1）轻微：前交叉韧带切断（ACL）；（2）适度：前交叉韧带联合内侧半月板切除(ACL+MM)；（3）中度：内侧副韧带联合内侧半月板切除(MCL+MM)；（4）严重：髌韧带合内外侧副韧带，内外侧半月板，前后交叉韧带全切除(PL+MCL+MM+ACL+PCL+LM+LCL)。

小鼠的手术造模的原理都是利用关节结构上的不完整增加关节不稳定性，这样长远可以加速关节软骨的磨损。造模完成一般需要4～8周，不同的模型的操作复杂性和病程发展的观察可控性都有差别。在2013年已发表的有关GM小鼠OA造模文章中都有使用到手术法。

2 实验模型的选择

OA病症纷繁复杂，可归纳出疼痛、功能障碍，病理生化改变3个主要方面。目前模型小鼠多用于模拟病理生化改变。

可根据模型特色选择合适造模法，如近来MIA注射模型的OA研究多集中于疼痛学方面；手术造模的软骨基质降解和破坏非常显著；而TTR跑步机模型则可获得不同严重程度和急慢时相的OA模型，同时可行步态分析评估功能改变。

其次，需要考虑到实验外部条件限制，比如时间成本。注射药物造模时间一般小于1个月，而手术造模则需要1～3个月。另外，像MIA、木瓜蛋白酶、胶原酶、抗原免疫及跑步机模型都需要有小鼠关节腔注射工具。在手术造模中，不同的术法难度也不一样，如因为有后十字韧带(PCL)干扰，前交叉韧带（ACLT）切断术相对DMM较为复杂，要求实验者有较为熟练的操作技巧。

同时，可以在实验中使用多模型同时验证以增加可靠性和说服力，不同模型的组合尚没有明确说法。最后，从动物保护角度出发，应尽量遵从3R原则。

3 小鼠模型的不足和展望

OA是个年龄相关性疾病，可是目前模型使用的实验鼠多是年轻鼠（10周内），无论是关节的疼痛，功能障碍还是组织化学的改变都没有把年龄相关因素考虑在内。此外，小鼠的骨骼成熟后剩余寿命比例相对于大动物（猪、狗）较小，这部分时间对于OA进展至关重要，所以也就可能相对限制了实验中模型小鼠OA样改变的进展。

OA是全身性疾病，而小鼠模型大多集中研究膝关节。研究主要关注模型小鼠软骨破坏，对其他组织如韧带、关节囊、肌肉等鲜有涉及。同时，个别造模效果需要重新验证，如小鼠手术模型模拟创伤性关节炎方法尤多，但是文献中给的相关的疼痛，运动障碍，生化改变的数据甚少以至于无法全面判断模型效果。

模型构建过程，GM小鼠（特别是全身某基因敲出）可能会在行为上和同遗传背景的普通鼠有区别（如生病、活动量、进食量），目前尚没有相关报道讨论这是否会对实验最后基因修饰因素产生的差异性结果造成影响。

综上所述，虽然存在不足，但总的来说，对于骨性关节炎研究除了小鼠在基因修饰方面的无可比拟的优势以外，小鼠购买和饲养成本低和操作相对简单的好处都是显而易见。因此，随着OA研究的进一步深入及GM小鼠的逐渐普及，小鼠骨性关节炎模型有必要进行广泛而细致的研究、探讨和系统归类。

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[10]Kamekura S,Hoshi K,Shimoaka T,et al.Osteoarthritis development in novel experimental mouse models induced by knee joint instability[J].Osteoarthritis Cartilage,2005,13(7):632-641.