琥珀酸脱氢酶B和丙酮酸脱氢酶激酶1在鼻咽癌组织中的表达及其临床意义

林森，陈崇喜，王春雷，廖志苏

（1.温州医科大学附属第三医院 耳鼻咽喉科，浙江 温州 325200；2.温州医科大学附属第一医院耳鼻咽喉科，浙江 温州 325015）

·论 著·

琥珀酸脱氢酶B和丙酮酸脱氢酶激酶1在鼻咽癌组织中的表达及其临床意义

林森1，陈崇喜1，王春雷1，廖志苏2

（1.温州医科大学附属第三医院 耳鼻咽喉科，浙江 温州 325200；2.温州医科大学附属第一医院耳鼻咽喉科，浙江 温州 325015）

目的：探讨琥珀酸脱氢酶（SDH）B和丙酮酸脱氢酶激酶（PDK）1在鼻咽癌组织中的表达及其临床意义。方法：采用免疫组化法检测78例鼻咽癌组织及35例鼻咽黏膜慢性炎症组织中SDHB和PDK1的表达情况，运用x2检验分析SDHB和PDK1表达与鼻咽癌患者临床病理因素的关系，运用Kaplan-Meter法分析其与预后的关系。结果：SDHB和PDK1在鼻咽癌组织中阳性表达率分别为39.7%（31/78）和53.8%（42/ 78），而在鼻咽黏膜慢性炎症组织中为62.9%（22/35）和20.0%（7/35），SDHB和PDK1表达均与鼻咽癌复发、颈部淋巴结转移相关（P＜0.05），与患者性别、年龄等无显著相关（P＞0.05）。K-M生存曲线提示SDHB阳性表达和PDK1阴性表达者的生存率分别高于SDHB阴性表达和PDK1阳性表达者，多因素Cox回归分析显示，T分级、临床分期、复发是影响鼻咽癌患者预后的独立因素，SDHB和PDK1表达不能作为影响鼻咽癌预后的独立因素。结论：SDHB和PDK1表达在鼻咽癌的发展、淋巴结转移、复发中起着重要作用，并可能对预后有影响，但SDHB和PDK1表达不是影响预后的独立因素。

鼻咽肿瘤；琥珀酸脱氢酶B；丙酮酸脱氢酶激酶1；临床病理；预后

尽管放化疗技术不断发展，但鼻咽癌的病死率仍位居耳鼻咽喉头颈外科之首，大多数患者发现时常已有颈部淋巴结和远处转移，确诊时已是第I I I期或第IV期。近些年来由于肿瘤细胞的糖代谢特异性重新引起人们的高度重视，探索通过靶向糖代谢途径治疗恶性肿瘤的策略正备受关注，然而对恶性肿瘤的糖代谢过程中关键酶的选择是一个很关键的问题。琥珀酸脱氢酶（succinate dehydrogenase subunit，SDH）B位于线粒体内膜，是线粒体呼吸链的组成部分，丙酮酸脱氢酶激酶（pyruvate dehydrogenase kinase，PDK）1是细胞糖酵解关键限速酶丙酮酸脱氢酶的调节酶，本实验应用免疫组化技术分析SDHB和PDK1在鼻咽癌以及鼻咽黏膜慢性炎症组织中的表达情况及其临床意义，探讨了SDHB和PDK1在鼻咽癌发生、发展、转移和复发等中的作用。

1 资料和方法

1.1 一般资料收集2007年1月至2010年6月温州医科大学附属第三医院病理科具有完整随访资料的鼻咽癌活检标本78例，其中男53例，女25例，年龄35～79岁，中位年龄45岁。于2010年1月至2012年1月进行随访，生存期计算从病理确诊到随访截止日期，或由于复发、转移而死亡的日期。按WHO国际组织分类标准分类：角化性鳞状细胞癌8例，分化型非角化21例，未分化型非角化性癌49例；按国际抗癌联盟（UICC）临床TNM分期：I～I I期50例，I I I～IV期28例；伴有淋巴结转移43例，不伴淋巴结转移35例。另取35例鼻咽黏膜慢性炎症组织标本作为对照组。

1.2 主要试剂及检测方法SDHB和PDK1单克隆抗体为美国Abcam公司产品，相关试剂盒购自上海长岛生物技术有限公司，采用PV-6000二步法检测，操作步骤按说明书进行，以PBS代替一抗作阴性对照。SDHB和PDK1阳性反应均多定位于胞浆，偶见于胞膜和胞核；表现为呈浅棕到棕色颗粒。随机观察10个高倍镜视野，按每视野阳性细胞数百分比记分：阳性细胞数＜5%为0分，5%～25%为1分，26%～50%为2分，5l%～75%为3分，＞75%为4分。按着色强度记分：染色呈淡黄色者记为1分，染色呈黄色者记为2分，染色呈棕黄色者记为3分。两种记分的乘积即为阳性强度：0分为阴（-），1～4分为弱阳性（+），5～8分为中度阳性（++），9～12分为强阳性（+++）。本研究在进行数据处理时，以阴性（-）、弱阳性（+）作为阴性组，以中度阳性（++）、强阳性（+++）作为阳性组。

1.3 统计学处理方法采用SPSS16.0统计软件包进行统计学处理。SDHB和PDK1表达与临床分期、颈淋巴结转移、肿瘤复发率、颅神经侵犯等的比较采用x2检验，生存分析采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，并以Log rank法进行检验，Cox风险模型进行独立预后因素分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SDHB和PDK1在鼻咽癌组织和鼻咽黏膜慢性炎症组织中的表达情况经统计，SDHB和PDK1在鼻咽癌组织中阳性表达率分别为39.7%（31/78）和53.8%（42/78），在鼻咽黏膜慢性炎症组织中阳性表达率分别为62.9%（22/35）和20.0%（7/35），阳性表达主要分布在细胞质中，亦可见细胞核（见图1-4），不同组织SDHB和PDK1蛋白表达差异有统计学意义（分别x2=5.183，P＜0.05；x2=11.269，P＜0.05）。

图1 SDHB蛋白在鼻咽黏膜慢性炎症组织中的表达情况（×200）

图2 SDHB蛋白在鼻咽癌组织中的表达情况（×200）

图3 PDK1蛋白在鼻咽黏膜慢性炎症组织中的表达情况（×200）

图4 PDK1蛋白在鼻咽癌组织中的表达情况（×200）

2.2 鼻咽癌组织中PDK1和SDHB蛋白表达与临床病理特征的关系由表1可见，不同病理类型的鼻咽癌PDK1和SDHB蛋白的表达水平明显不同，SDHB在鼻咽癌组织中呈低表达，I I I～IV期阳性表达率低于I～I I期，在复发鼻咽癌组织中表达低于初发鼻咽癌，颈部淋巴结转移者表达低于无颈部淋巴结转移者（P＜0.05），而PDK1在鼻咽癌组织中呈高表达，在鼻咽癌复发、颅神经侵犯、颈部淋巴结转移者中呈高表达（P＜0.05）。两者与患者性别、年龄等无显著相关性（P＞0.05）。

表1 鼻咽癌组织中SDHB和PDK1蛋白表达与临床病理特征的关系

2.3 PDK1和SDHB蛋白的表达与患者预后的关系

图5 SDHB蛋白阳性表达组和阴性表达组患者的生存曲线

图6 PDK1蛋白阳性表达组和阴性表达组患者的生存曲线

生存分析（见图5-6）显示，SDHB阳性表达组患者的中位生存时间为59个月，阴性表达组为57个月，阳性表达组和阴性表达组3年、4年和5年生存率分别为96.8%、92.7%、38.2%和97.8%、71.5%、32.0%（P=0.018）；PDK1蛋白阳性表达组患者的中位生存时间为57个月，短于阴性表达组（60个月），3年、4年和5年生存率PDK1蛋白阳性表达组和阴性表达组分别为95.2%、80.1%、28.7%和97.2%、91.1%、42.4%（P=0.013）。多因素Cox回归分析显示，T分级（P=0.001）、临床分期（P=0.023）、复发（P= 0.039）是影响鼻咽癌患者预后的独立因素，而SDHB（P=0.142）和PDK1（P=0.098）表达不能作为影响鼻咽癌患者预后的独立因素。

3 讨论

SDH作为参与三羧酸循环的一个重要的催化酶，是反映线粒体功能的标志酶之一。SDHB是SDH的催化亚基，其表达缺失可导致SDH活性的丧失，引起线粒体三羧酸循环功能障碍，导致肿瘤细胞能量代谢紊乱。Fishbein等[1]在139例嗜铬细胞瘤和神经节细胞瘤恶变患者中发现有41%发生基因变异，最常见的突变基因就是SDHB。van Hulsteijn等[2]发现恶性神经节细胞瘤患者中SDHB基因发生突变率要比SDHD高。Patterson等[3]应用RT-PCR技术证明了SDHB基因突变可区分恶性和良性嗜铬细胞瘤。Yang等[4]应用RT-PCR技术和Western blot法通过检测SDHB mRNA和蛋白的表达发现SDHB在嗜铬细胞瘤和神经节细胞瘤的发病机制中起着至关重要的作用。Matro等[5]发现SDHB可作为治疗嗜铬细胞瘤和家族性副神经节瘤综合征几个有前景的靶基因之一，从非特异性治疗模式转向更具选择性的分子靶向治疗。

PDK是细胞糖酵解关键限速酶丙酮酸脱氢酶（PDH）的调节酶，PDK1是PDK的一种同工酶。Fujiwara等[6]使用real-time PCR技术发现PDK1在多发性骨髓瘤细胞中呈高表达，表达程度与患者预后有关，抑制PDK1可以作为一种新的靶向治疗手段。Hur等[7]认为PDK-1可以作为胃癌患者预后不良的标志物，此外，PDK抑制剂被认为是治疗PDK1高表达胃癌患者的另外选择。Peifer等[8]认为磷脂酰肌醇-3-羟激酶抑制剂、PDK同工酶抑制剂可能使抗乳腺癌药物他莫昔芬有额外的效用，还讨论了抑制PDK1通路有助于克服抗癌药物产生耐药的可能性。Wigfield等[9]利用RNAi下调PDK1，发现低氧16～48 h后的乳酸和丙酮酸排泄水平受到抑制，与不良预后密切相关（P＜0.005）。Yu等[10]用RT-PCR技术和Western blot法分析评估PDK1蛋白和mRNA的表达与下游Akt蛋白的磷酸化水平有关，PDK1可能与食管癌细胞凋亡、增殖和侵袭密切相关。

本实验研究结果显示SDHB在鼻咽癌组织中呈低表达，却在鼻咽黏膜慢性炎症组织中呈高表达。SDHB蛋白在复发鼻咽癌中的表达明显低于初发鼻咽癌[11-12]；颈部淋巴结转移者低于无颈部淋巴结转移者，与患者性别、年龄等无显著相关性。因此我们推测SDHB低表达不仅参与鼻咽癌的发展，还可能在肿瘤的复发中也发挥着重要作用。生存曲线显示SDHB表达与鼻咽癌患者的生存时间有关，SDHB阳性表达组患者的中位生存时间为59个月，阴性表达组57个月，SDHB阳性表达生存率比SDHB阴性表达要高，因此可以认为鼻咽癌患者SDHB低表达者预后较差。然而Cox回归分析显示，SDHB低表达不能作为影响鼻咽癌患者预后的独立因素。实验还发现PDK1在鼻咽癌组织中呈高表达，PDK1蛋白在复发鼻咽癌中的表达明显高于初发鼻咽癌；颅神经麻痹表达阳性率明显高于无颅神经麻痹，颈部有淋巴结转移者明显高于无颈部淋巴结转移者；与患者性别、年龄、临床分期等无显著相关性。生存时间分析结果显示，PDK1蛋白阳性表达组患者的中位生存时间为57个月，短于阴性表达组的60个月，生存率比较差异有统计学意义（P=0.013）。Cox回归分析显示肿瘤T分级、临床分期、复发是影响鼻咽癌患者预后的独立因素，PDK1高表达也不能作为影响鼻咽癌患者预后的独立因素。

近年来，能量代谢紊乱在肿瘤发生与演变过程中的作用及机制逐渐受到重视，通过干预能量代谢方式抑制肿瘤生长已经成为肿瘤研究与治疗的一个新的思路。我们分析，SDHB表达下调或PDK1表达上调，造成肿瘤细胞内线粒体三羧酸循环的功能障碍及能量代谢发生紊乱，从而导致恶性肿瘤形成，同时还发现能量代谢紊乱可能与鼻咽癌预后有关。

[1]Fishbein L, Merrill S, Fraker DL, et al. Inherited mutations in pheochromocytoma and paraganglioma: why all patients should be offered genetic testing[J]. Ann Surg Oncol, 2013, 20(5): 1444-1450.

[2]van Hulsteijn LT, Dekkers OM, Hes FJ, et al. Risk of malignant paraganglioma in SDHB-mutation and SDHD-mutation carriers: a systematic review and meta-analysis[J]. J Med Genet, 2012, 49(12): 768-776.

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（本文编辑：胡苗苗）

Expressions of SDHB and PDK1 and their clinical significance in nasopharyngeal carcinoma

LIN Sen1,

CHEN Chongxi1, WANG Chunlei1, LIAO Zhisu2.1.Department of Otolaryngology, the Third Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325200; 2.Department of Otolaryngology, the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325015

Objective: To investigate the expressions of SDHB and PDK1 and their correlation with the clinicopathological factors and prognosis in nasopharyngeal carcinoma (NPC).Methods:Immunohistochemstry was employed to analyze the expressions of SDHB and PDK1 in 78 specimens of NPC and 35 specimens of chronic nasopharyngitis tissues (CNT). Retsults: SDHB expression detected in 39.7% of the cancer tissues was significantly lower than those in 62.9% of nasopharyngitis tissues (x2=5.183, P<0.05). While PDK1 expression detected in 53.8% of the cancer tissues was significantly higher than those in 20.0% of nasopharyngitis tissues (x2=11.269, P<0.05). SDHB and PDK1 expressions were significantly associated with lymph node metastasis, tumor recurrence, cranial nerve palsy. however, there was no significant association between the expression and gender, age. Kaplan-Meter survival analysis showed that the survival rates of positive SDHB expression and negative PDK1 expression were higher than that of negative SDHB expression and positive PDK1 expression. Multivariate Cox regression analysis showed that the development of NPC, lymph node metastasis and recurrence were independent prognostic factors for NPC, but the expressions of SDHB and PDK1 were not an independent factor.Conclusion:The expressions of SDHB and PDK1 play an important role in the development of NPC, lymph node metastasis and recurrence. SDHB and PDK1 expressions may have an impact on prognosis, but it was not independent factor affecting the prognosis in pafients with NPC.

nasopharyngeal neoplasms; succinate dehydrogenase subunit B; pyruvate dehydrogenase kinase 1; immunohistochemistry; prognosis

R766.3

A

1000-2138（2014）02-0091-04

2013-05-06

温州市科技计划项目（Y20120022）；瑞安市科技计划项目（201203081）。

林森（1971-），男，浙江瑞安人，主治医师，硕士。

廖志苏，教授，硕士生导师，Email：Liaozhisu111@163.com。