丹参对暴发性肝衰竭大鼠肝损伤及肝再生的影响*

朱 琥 朱清静

武汉市医疗救治中心(湖北 武汉，430023)

数年前我们报导了丹黄方具有促进大鼠肝再生的作用，在本文中我们将进一步观察丹参对FHF 大鼠肝损伤的影响及其促进行肝细胞再生的作用。

1 材料与方法

1.1 动物与试剂 SPF 级Wistar 大鼠，体重(220.4 ±20.8)g，雌雄各半，购自湖北省医学科学院医学院动物中心。硫代乙酰胺(TAA):上海化学试剂公司生产，批号为20030324。PCNA 试剂盒(武汉博士德公司产品)。丹参注射液为丹参水煎醇沉浓缩成每ml 含生药1g 的提取液，由湖北中医药大学提供。PHGF 购自上海赛达生物药业有限公司，批号为20030701。

1.2 实验方法 取Wistar 大鼠113 只，体重(180～230)g，雌雄兼用，随机分为4 组:正常对照组8 只，FHF 组35 只，丹参组30 只，PHGF 组30 只。实验开始，FHF、丹参组和PHGF 组动物模型采用TAA 皮下注射，剂量按每kg 体重600mg，2 次，间隔24h，复制FHF 动物模型。丹参组和PHGF 组动物除皮下注射TAA 外，于实验前3 天至实验结束分别于皮下注射丹参注射液1ml/100g 和PHGF 1ml/100g，FHF 组大鼠同时皮下注射生理盐水1ml/100g 。FHF 组、丹参组和PHGF 组，于第2 次注射TAA 后24h，随机取大鼠各8 只，麻醉后腹主动脉取血测肝功能。随后迅速取肝左中叶组织，用10%甲醛液固定，制成石蜡切片，备检。其余大鼠用于36h病死率观察。

1.3 观察指标与方法

1.3.1 肝功能 丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)及总胆红素(TBil)含量，全自动生化分析仪测定。

1.3.2 肝细胞MI 普通病理切片常规染色后，计数1 000 个肝细胞中有丝分裂肝细胞数目，换成百分比。

1.3.3 肝细胞PCNA 石蜡切片经脱蜡水化后，以磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗，加10%正常羊血清封闭，顺序加一抗、二抗、三抗，继之以PBS 冲洗，以联苯二氧胺(DBA)显色，甲基绿复染。胞核显示棕褐色为PCNA 阳性。PCNA 标记指数以随机选择高倍视野中至少1 000 个细胞，计数的PCNA 阳性核的百分数来表示 (阳性核数目/计数的肝细胞总数×100%)。

2 结果

2.1 各组动物病死率的情况 FHF 组36h 病死率67.5 %(25/37)，丹参组和PHGF 组36h 病死率分别为36.3 % (8/22)、40.9 % (9/22)，与模型组比较差异具有显著性意义(P ＜0.05)。

2.2 各组动物的肝功能情况 见表1。从表1 可知，丹参具用一定的降低ALT、AST 和TBil 的作用，与FHF 组比较有显著性差异，但与PHGF 组比较，无显著性差异。

表1 各组动物的肝功能情况比较(±s)

表1 各组动物的肝功能情况比较(±s)

与正常组比较，○P ＜0.05，* P ＜0.01;与FHF 组比较，▲P ＜0.05△P ＜0.01

2.3 肝再生指标检测结果 见表2。从表2 可知，丹参具有显著提高肝细胞MI 和PCNA 的作用，与FHF 组比较差异有显著性意义(P ＜0.01)，但与PHGF 组比较，差异无显著性意义。

表2 各组动物肝细胞MI 和PCNA 结果(±s)

表2 各组动物肝细胞MI 和PCNA 结果(±s)

与正常组比较，* P ＜0.01;与FHF 组比较，△P ＜0.01

3 讨论

正常情况下，肝细胞增殖极少，然而肝损伤后，尤其是肝切除后，肝脏表现出惊人的增殖能力，但对FHF 时肝再生的变化存在着不同看法。Saunder 曾认为FHF 的发生与FHF缺乏肝再生有关，改善患者存活率在于用肝细胞营养因子刺激肝再生，促进肝功能恢复［1］。然而许多实验研究表明，肝细胞营养因子只能提高非致死量药物引起的肝损伤、肝衰竭动物的存活率，对于致死量药物引起的严重肝损伤，治疗无效［2］。Wolf 用PCNA 免疫组化方法，比较FHF、急性肝炎肝再生的变化，指出了FHF 残留肝细胞似乎达到或接近最大增殖能力，对于FHF 处理在于减少肝细胞坏死而不是刺激肝细胞再生［3］。PCNA 是与细胞增殖密切相关的核内酸性蛋白质，其分子量在33～36KD 之间，由261 个氨基酸组成。PCNA 存在并合成于核内，静止细胞中PCNA 含量很少，增殖细胞和转化细胞中其含量发生明显变化，大部分G0～G1 期细胞无明显的PCNA 表达，G1 晚期其表达度增加，S 期达到高峰，G2～M 期下降，其含量和表达强弱的变化与DNA 合成及DNA 复制的活跃程度一致。因此，PCNA 是评价肝脏再生的一个指标。

药理学研究表明，丹参有改善微循环、增加毛细血管网、扩张血管、抑制凝血、激活纤溶等作用。李焰等［4］探讨FHF时丹参对肠系膜微循环的作用，结果丹参治疗组动物血浆内毒素水平为(013274 ±0.10752)Eu/ml，明显低于对照组(P＜0.05)，同时肠系膜微循环灌流得到显著改善，结果表明丹参治疗FHF 可能与降低血浆内毒素水平、改善微循环有关。张志伟等［5］采用大鼠部分肝缺血后肝部分切除模型，研究了术后第1、3、7d 残肝肝再生度、肝细胞MI、血清甲胎蛋白(AFP)阳性率、血清ALT 和白蛋白(Alb)的变化，以及动物10d 存活率。结果显示:丹参组大鼠ALT 和Alb 术后第7d恢复到正常水平，10d 存活率为66.7% (缺血组为25%，P ＜0.05)，术后第3 天AFP 阳性率为85.7% (缺血组为33.3%，P ＜0.05)，与缺血组比较，术后残肝再生度和肝细胞MI 增加。结果表明，丹参对缺血残肝再生有明显促进作用。王俊萍等［6］研究认为，丹参具有促进肝脏再生的作用，可部分逆转酒精性肝损伤肝脏DNA 合成和再生能力的抑制作用。

我们前期研究结果表明丹黄方明显促进肝再生大鼠HGF mRNA、Tec mRNA、c-fos mRNA 及PC3 mRNA 的表达，与模型组比较，差异有显著性意义(P ＜0.01);丹黄方可上调LRF-1 mRNA 的表达，下调TGF-β1mRNA 的表达，与模型组比较，但差异无显著性意义(P ＞0.05)。丹黄方具有促进大鼠肝再生的作用［7～9］。

本实验中，PCNA 在正常组肝细胞中表达较弱，在模型组中表达增强，说明模型组肝细胞处于G1 及S 期的比例增多，细胞增殖旺盛，在丹参组和PHGF 组PCNA 表达强于模型组，说明中药丹参有促进肝细胞再生的作用。

［1］Saunder SJ，Macdonald R，Terblenche J.The treatment of actue liver failure.In:Popper H，Schaffner Feds.Progress in liver disease.vol4［M］.New York:Grune GL Stratton，1972:33340.

［2］Fujiwara K，Ogata I，Tomiya T，et al.Insulin and glucogen therapy of acute hepatic failure ［J］.Dig Dis Sci，1991，36 (6):8093.

［3］Wolf HK，Michalopoulos GK.Hepatocyte regeneration in acute fulminant and nonfulminant hepatitia:a study of proliferation cell nucier antigen expression ［J］.Hepatology，1992，15:707.

［4］李焰，郜玉珍，吴筱芳，等.丹参对暴发性肝衰竭肠系膜微循环改善作用的实验研究［J］.中国冶金工业医学杂志，1998，15(1):9.

［5］张志伟，吴在德.丹参对大鼠肝缺血后残肝再生促进作用的初步观察［J］.同济医科大学学报，1995，24 (4):272.

［6］王俊萍，王思元.酒精对大鼠残肝再生的影响及丹参的保护作用［J］.深圳中西医结合杂志，2000，10 (5):102 -103.

［7］朱清静.丹黄方对大鼠肝再生过程中PC3、c-fos、LRF-1 影响的实验研究［J］.中西医结合肝病杂志，2008，18 (1):32-34，37.

［8］朱清静，陈锋，盛国光.丹黄方对部分肝叶切除大鼠肝组织中肝细胞生长因子的影响［J］.中国中西医结合消化杂志，2008，16(3):168 -171.

［9］朱清静，陈锋，盛国光.丹黄方对部分肝叶切除大鼠肝组织中TEC 影响［J］.临床肝胆病杂志，2009，(1):41 -43.