白介素-17 在自身免疫性肝炎中的作用及其机制研究*

余海静 黄加权 刘 阳 余世敏 张建军△

1.湖北省中山医院肝病科(湖北 武汉，430033) 2.华中科技大学同济医学院附属同济医院感染科 3.华中科技大学同济医学院附属同济医院耳鼻咽喉科

AIH 是一种慢性炎症性肝脏疾病。主要特点为:女性易患，界面性肝炎，转氨酶升高，循环中存在自身抗体，高γ-球蛋白血症，具有免疫易感背景，常伴有肝外自身免疫综合征，尽管用免疫抑制剂进行治疗仍会进展成肝硬化，甚至导致肝衰竭［1］。AIH 是难治性肝炎，目前存在病因不明、诊断标准复杂、容易复发和预后不良等问题，并且治疗上长期使用糖皮质激素或者免疫抑制剂都需要经过缜密思考、权衡利弊，并注意随访观察，给临床工作带来诸多不便。AIH 的发病机制尚不清楚，有研究表明与遗传和环境因素有关，针对于宿主肝脏抗原的免疫反应也被认为是肝脏损伤的主要机制［1］。T 淋巴细胞在AIH 的免疫机制中发挥了重要的作用［2］。目前，AIH 的发病机制正成为全世界科学家日益关注的课题。

近年来，一种新型的辅助T 细胞亚型Th17 细胞被发现，Th17 细胞主要分泌IL-17A、IL-17F、IL-21、IL-22 和IL-6，它通过分泌IL-17 和IL-22 等细胞因子参与机体的抗感染机制［3，4］。新近有研究表明Th17 细胞在变态反应性疾病及某些自身免疫性疾病中起重要作用［5～7］。另一方面，Th17 细胞潜在的促炎症作用导致了肝损伤。在人和小鼠的肝脏炎症损伤中均可见到IL-17 的表达。IL-17 是Th17 细胞分泌的主要细胞因子，也是其执行主要生物功能的主要细胞因子。其对中性粒细胞有强大趋化作用，在介导炎症反应、自身免疫性疾病、肿瘤、移植排斥反应等过程中发挥重要作用。鉴于此，我们开展了对IL-17 在AIH 中作用机制研究。

1 材料与方法

1.1 临床资料 12 例AIH 患者均为2008年8 月-2009年9月在华中科技大学同济医学院附属同济医院感染科住院及门诊患者，其中女10 例，男2 例，女性占83.3%;平均年龄(45.3 ± 8.1)岁;ALT (67.6 ± 48.5)U/L;AST (97.0 ±47.0)U/L;TBil (59.4 ± 32.7)μmol/L;DBil (45.1 ±26.8)μmol/L;抗核抗体(ANA)为100%;抗肝肾微粒体抗体(LKM1)占80%;抗平滑肌抗体(SMA)占20%。所有患者的诊断均符合1999年国际AIH 小组修订的AIH 诊断积分系统中的诊断标准［8］。健康对照者来自于同济医院感染科健康志愿者和体检者。其中女10 例，男2 例，女性占83.3%;平均年龄(39.7 ±3.1)岁。ALT (23.4 ±5.0)U/L、AST (23.1 ±5.2)U/L、TBil (13.3 ±5.5)μmol/L、DBil(4.0 ±1.4)μmol/L，ANA 为5%，LKM1 和SMA 为0。所有标本收集均在患者知情同意的情况下进行，并签署相关的《知情同意书》。

1.2 实验动物 6～8 周龄C57BL/6 雄性小鼠(购于中科院上海实验动物中心)，体重18～22 g 。实验期间小鼠于IVC(智能型独立送回风净化笼具)条件下饲养。本动物实验研究经过华中科技大学同济医学院附属同济医院实验动物委员会批准。

1.3 实验方法

1.3.1 实时定量PCR 方法检测PBMC 中IL-17 的表达 ①PBMC 的分离及保存:收集健康对照组人员及AIH 患者(肘静脉取)外周血2～4ml，肝素钠抗凝;加入等体积PBS 混匀;在无菌15ml 离心管中加入与外周血等体积的人淋巴细胞分离液(购自上海国药集团化学试剂有限公司)，然后沿管壁缓慢将稀释后的血液加到淋巴细胞分离液上(注意:勿打动液面);室温离心，2 000rpm ×20min;用毛细管吸取血浆与淋巴细胞分离液之间的PBMC 薄层(带入上下层液体尽量少，以免混入其他细胞);加入(吸出液)5 倍体积的PBS，混匀。室温离心，1 700rpm ×10min，弃上清液;加入2ml PBS，混匀，室温离心1 000rpm ×5min，弃上清液;重复1 次，再加入适量PBS，吹匀，计数，然后将细胞浓度调至1 ×107/ml。②检测IL-17 的表达:1μg PBMC 中总RNA 使用高保真逆转录试剂盒(Fermentas)逆转录成20μl 的cDNA，然后取2μl 的cDNA 稀释10 倍，使用SYBR Green I 掺入法进行QRT-PCR，退火温度均为60℃。基因的表达水平用看家基因GAPDH 进行矫正。mRNA 相对值计算公式:mRNA 相对值=IL-17 mRNA 测得值/相应GAPDH mRNA 测得值。使用的引物序列及其产物片断大小参见表1。

表1 引物序列及其产物片断大小

1.3.2 动物模型的建立 50 只小鼠随机分为2 组:模型组和对照组，各25 只。同种系小鼠的肝脏经过超声破碎后超速离心，其上清液含肝抗原(S-100)。新鲜制备的0.5ml S-100肝抗原与等体积的弗氏完全佐剂(CFA)充分乳化后，分别在第1d 和第7d 经腹腔注射入模型组小鼠体内造模;而对照组小鼠则用生理盐水与CFA 充分乳化后予以腹腔注射。在第二次免疫注射后的第14d 将两组小鼠处死。摘眼球取血，检测小鼠血清中ALT 变化。并采集其肝脏组织标本。

1.3.3 模型组小鼠的中和试验 在造模成功后第10d，对8只模型组小鼠尾静脉注射IL-17 中和抗体 (a-IL-17，clone 50104.11;R＆D Systems，Abingdon，UK)1 次;另8 只尾静脉注射同型对照抗体小鼠IgG2a (clone R35-95;BD Biosciences Europe，Erembodegem，Belgium)1 次。注射液体量均为200μl。

1.3.4 观察小鼠肝脏病理学变化 用4%多聚甲醛固定肝脏并石蜡包埋、切片。切片行苏木精-伊红染色。肝脏损伤程度分级如下:0 级，正常;1 级，少量炎症细胞浸润和散在点状肝细胞坏死;2 级，中度肝脏损伤伴有炎症细胞浸润和肝细胞局灶坏死;3 级，门静脉及小叶间有广泛的炎症细胞浸润和大范围肝细胞坏死。每个标本选择5 张切片进行观察分析，采用HM IAS-1000 高清晰度医学图文分析系统(武汉千屏医学影像技术公司)进行定量组织病理学分析，肝脏内中性粒细胞数目以每平方毫米中性粒细胞个数表示(个/ mm2)(补充中性粒细胞计数方法)。

1.4 统计学方法 所有实验数据用均值±标准差表示。数据运用t 检验和方差分析，以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PBMC 中IL-17 的表达 AIH 患者PBMC 中IL-17 的表达与健康对照者相比，其IL-17 mRNA 水平明显升高(高于健康对照者上限10 倍以上，P ＜0.01)(如图1 所示)。

2.2 小鼠血清中ALT 变化 分别检测注射IL-17 中和抗体和同型对照抗体后的小鼠肝功能ALT。与同型对照抗体小鼠相比，注射IL-17 中和抗体小鼠血清ALT 水平明显下降(如图2所示)。

图1 两组人员PBMC 中IL-17 的表达情况

图2 两组小鼠血清ALT 检测结果

2.3 小鼠肝脏病理组织学变化 造模成功后，分别用IL-17中和抗体及其同型对照抗体处理。取其肝脏组织标本，观察肝脏损伤程度，采用IL-17 中和抗体处理后的小鼠肝组织炎症反应主要分布在中央静脉、肝血窦、小叶间动脉和肝门静脉周围。炎症细胞(主要为淋巴细胞以及少量的中性粒细胞)大量浸润，广泛分布于中央静脉周围的肝血窦内。而同型对照抗体处理的小鼠肝小叶结构明显破坏，出现肝细胞点状坏死甚至碎片状坏死(见插页图3a 所示)。而IL-17 中和抗体处理的小鼠，肝脏组织结构基本保持完整，未见到明显的变性及坏死，其肝脏炎症变化程度明显降低。(见插页图3b 所示)。

3 讨论

本研究中，我们观察到IL-17 在AIH 患者及模型小鼠发病中的重要作用。与健康对照者相比，AIH 患者PBMC 中IL-17 的水平显著性升高。在AIH 小鼠模型中，我们用IL-17 中和抗体进行干预后，可以看到小鼠肝功能(ALT)水平明显下降，并且肝脏损伤程度明显减轻。

最新报道显示，在多种肝脏疾病中IL-17 表达量均显著升高，并促进肝脏多种细胞分泌细胞因子从而加剧肝损伤。新的研究表明分泌IL-17 的淋巴细胞亚型可能为CD4+T 淋巴细胞、CD8+T 淋巴细胞、NKT 细胞以及调节性T 细胞(Treg 细胞)［9］。我们前期的研究发现，AIH 模型小鼠肝脏中IL-17 表达阳性的细胞主要来源于汇管区浸润的炎性细胞，并且主要是淋巴细胞［10］。

尽管目前有研究表明在一些肝脏疾病中，IL-17 的表达是明显增高的，但其在AIH 发病中的作用还鲜有报道。事实上，目前仅有一篇研究显示在原发性胆汁性肝硬化小鼠中IL-17 是升高的。然而，相关的研究并没有涉及到IL-17 在该疾病中的具体作用机制。我们的前期研究已经证实了IL-17 在抗原诱导的肝脏炎症细胞的募集中起了关键作用。并且，本研究显示IL-17 中和抗体能减轻肝脏损伤。表明了IL-17 导致了AIH 的发生。迄今为止，关于IL-17 阻断的具体机制仍有待于进一步探讨。在其他慢性炎症性疾病中，已有研究证实IL-17 能吸引中性粒细胞，并且抑制嗜酸性粒细胞的浸润，且使树突状细胞失活。然而，在该模型中IL-17 导致了AIH 的发生的作用机制尚需进一步深入研究。

总之，IL-17 在AIH 的肝脏损伤中起了重要的作用。AIH小鼠模型中，IL-17 中和抗体能显著性减轻小鼠肝脏组织中炎症反应。但其具体的作用机制还有待进一步研究。而这为AIH 的治疗提供了潜在的治疗方法，也即提供了更为广阔的思路。

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