实时荧光定量PCR技术在肠道微生物领域中的研究进展

赵洁 马晨 席晓敏 张和平

（内蒙古农业大学 乳品生物技术与工程教育部重点实验室，呼和浩特 010018）

实时荧光定量PCR技术在肠道微生物领域中的研究进展

赵洁 马晨 席晓敏 张和平

（内蒙古农业大学 乳品生物技术与工程教育部重点实验室，呼和浩特 010018）

实时荧光定量PCR技术是目前发展起来的快速、精确定量核酸的最有效的方法之一，是生物定量分析的强有力的手段。与宏基因组测序等测序技术相比，实时荧光定量PCR技术能确定出样品中菌体的具体数量，同时具有操作简便、快速高效、特异性强、高通量等特点，因此被广泛应用于肠道微生物领域中。近年来，在肠道微生物和疾病的相关研究中，采用实时荧光定量PCR技术已成为趋势。综述了近几年实时荧光定量PCR在肠道微生物多样性和饮食干预在微生物菌群的基因组成方面的研究进展。

实时荧光定量PCR 肠道菌群 微生物多样性

人体寄居着大量的微生物，其中，肠道中的微生物约占微生物总量的78%，数量超过1 000万亿（1014数量级）。肠道微生物与宿主形成相互依赖、相互制约的统一体。肠道微生物影响着宿主的消化、免疫和代谢能力，以及宿主的健康状况；饮食、药物、环境等因素影响着肠道微生物菌群平衡。肠道微生物可分为3大类，第一类是有益菌，肠道的优势菌群，约占99%，如乳杆菌、双歧杆菌；第二类是条件致病菌，肠道的非优势菌群，典型的有肠球菌、肠杆菌，在肠道微生态平衡时对宿主无害，特定条件下对宿主有害；第三类是致病菌，当菌群失调时会使宿主患病［1］。肠道微生物组中发现有 9 个门的细菌，包括厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、梭杆菌科（Fusobacteria）、疣微菌门（Verrucomicrobia）、蓝细菌（Cyanobacteria）、螺旋体门（Spirochaeates）和VadinBE97门［2］。

肠道微生物菌群数量庞大，很多微生物无法体外培养，因此其多样性还未能被完全认识。分子生物学技术的发展促进了人类对肠道微生物多样性的认识。实时荧光定量PCR（Real-time PCR）技术凭借其简便、快速、高通量、无需体外培养等特点，广泛应用于肠道微生物菌群的研究当中。一般情况下，肠道微生物组成的研究分为两大类别，一种是

集中在确定特定基因组成的丰度，如16S rRNA基因；一种是集中在确定干预效果，如饮食干预在微生物群的基因组成方面的研究，根据具体系统分类单元或功能性基因丰度的改变确定结果。本文综述了近几年实时荧光定量PCR技术在肠道微生物多样性方面的研究进展，同时简单介绍了该技术在肠道微生物和疾病的相关研究中的应用。

1 实时荧光定量PCR技术

实时荧光定量PCR（qPCR）技术是在普通PCR技术基础之上发展起来的一种新型核酸定量技术。实验室常用的方法有SYBR Green和TaqMan探针法。SYBR Green是结合在双链的产物上的，TaqMan探针是特异性的针对目的片段设计的带有荧光标记的互补单链序列。SYBR Green在特异性和准确性方面不如TaqMan探针，但其造价相对较低。因此，在很多试验中SYBR Green的使用频率较高。

宏基因组测序目前在肠道微生物菌群的研究中应用广泛，但是与实时荧光定量PCR相比也有一定的缺陷，宏基因组测序技术能够确定样本中微生物的种类，却无法知道其数量的多少。实时荧光定量PCR可以发挥其优势，确定样本中某一菌种的具体数量，同时，通过量的对比，可以看出某一因素是否影响肠道微生物菌群。除此之外，实时荧光定量PCR技术还具有操作简便、快速、精确、高灵敏度和特异性强等优点。因此，该技术是研究肠道微生物菌群的有力工具。本文总结了几种近年研究中定量用到的引物，详情见表1。

2 肠道微生物多样性的研究

肠道中微生物种类多、数量大。宿主年龄、健康状况等影响其肠道微生物的种类和数量。许多分子生物学技术可用于肠道微生物多样性的研究。其中，实时荧光定量PCR技术凭借其复现性好、特异性强等优点，广泛地应用于肠道微生物菌群的定量分析［3］。

Jost 等［4］选择7个健康的母乳喂养婴儿的排泄物，采用传统培养法、实时荧光定量PCR技术检测出生后4-6 d、9-14 d、25-30 d的婴儿粪便中的细菌。结果显示，在所有婴儿出生后的第1天，厌氧菌数量超过兼性厌氧菌。拟杆菌是大多数婴儿肠道的第一种细菌，它的存在证明，出生一周之内的婴儿肠道内严格厌氧性菌达到了类似成人肠道的菌群密度。然而，婴儿期未测到主要是成人型产丁酸盐的厌氧菌。因此，有可能在母乳喂养婴儿期之前，婴儿肠道内兼性厌氧菌已经转变为严格厌氧菌，并且非厌氧条件限制了主要产丁酸菌群的建立，也有可能是其他因素。PCR定量双歧杆菌并不适合于以双歧杆菌为主的母乳喂养婴儿肠道微生物特性的研究。因此，Centanni等［5］采用了一种指纹图谱芯片技术与实时荧光定量PCR相结合的方法得到婴儿微生物群的可靠图谱。这个方法用于比较8位母乳喂养婴儿（2-6个月）和5位年轻成年人粪便微生物。结果显示，成人肠道菌群占主导地位的是厚壁菌门和拟杆菌门，而婴儿肠道菌群主要是双歧杆菌；其次为肠杆菌科。与最新相关研究一致，从新方法结果中获得的微生物群图谱适当的描述了成年人和婴儿肠道菌群情况，证明这种新方法在反映两种肠道微生物菌群特性方面具有可靠性。Wang 等［6］采用实时荧光定量PCR技术确定结肠直肠癌（CRC）患者（n=46）和健康志愿者（n=56）粪便中细菌的数量。结果表明，与健康志愿者相比，CRC患者肠道微生物菌群中产丁酸的细菌减少。因此，产丁酸细菌的减少和伺机致病菌的增加可能导致CRC患者肠道微生物主要结构的失调。由饮食、功能性食品、抗生素等引起的肠道微生物的改变与宿主的健康相关。因此，需要一个快速全面的方法检测肠道微生物菌群的改变。Bergström等［7］建立并确定一个高通量的以实时荧光定量PCR为基础的分析平台——肠道低密度阵列（GULDA）。这个平台同时用来分析不同时间采集的粪便样中31个不同微生物16S rRNA目标基因的丰度的改变。目标基因代表重要的类群、属、种或连同5个主要的肠道细菌类群，厚壁菌门、拟杆菌门、放线菌门、变形菌门、疣微菌门和广古菌门在内的其他分类群。Bergström等分析6个健康婴儿在出生第9个月和第18个月的粪便样品，结果显示，属于梭状芽孢杆菌和两歧双歧杆菌的细菌的相关丰度增加，同时丁酸梭状芽孢杆菌的丰度降低，超过9个月的婴儿粪便中的肠杆菌科也有减少的趋势。Wang等［8］利用实时荧光定量PCR分析定量患有自闭症儿童粪便中的细菌。经分析，患有自闭症儿童的肠道内缺乏双歧杆菌和黏液溶解的细菌，后者导致黏液屏障发生变化。Ishikawa等［9］通过实时荧光定量PCR技术对42个健康的比利时成人一个月内肠道微生物菌群的菌群大小和普遍性进行检测，主要针对6大细菌菌属、双歧杆菌属和脆弱拟杆菌中种的组成进行研究。试验期间，菌群大小和广泛性基本稳定。双歧杆菌和普氏菌属的丰度分别为97%和70%，活菌数数量级高达1010。起主导作用的双歧杆菌是青春双歧杆菌和长双歧杆菌；主要的拟杆菌是普氏拟杆菌、单形拟杆菌和卵形拟杆菌。之后将比利时人肠道微生物菌群数据与2014年Matsuki等研究的46名日本人肠道菌群相比较。比利时人肠道菌群中的链状双歧杆菌的菌群大小和广度明显低于日本人的（P＜0.001）；然而，双歧杆菌的菌群大小和广度却相同。这类种水平上的实时荧光定量PCR分析对于调查种族间的肠道微生物菌群的多样性有所帮助［9，10］。成年人和小孩的肠道菌群均具有多样性，但是很少有报道提供青少年的肠道微生物组成。Agans 等［12］利用高通量研究方法分析11-18岁青少年肠道末端的微生物群，并在成人组中取样作对比。

在主成分分析中将青少年组和成人组分开，主成分分析空间以肠道末端微生物菌群的相关菌种的丰度为基础。所有的样品中，梭状芽孢杆菌属占主导地位。在所有检测样中检测46个种的一个核心微生物组，核心种属中瘤胃球菌属、罗氏菌属具有很好的代表性。比较青少年和成人肠道微生物组成，数据显示青少年组中梭菌属和双歧杆菌属丰度明显高于成年组。不同样品组中检测的菌种的数量是一样的，这表示造成成年组和青少年组不同的是菌属的相关丰度而非具体菌属的存在或缺失。

表1 引物列表

实时荧光定量PCR技术为肠道微生物的研究提供了便利，通过对人体肠道微生物的定量，我们了解到婴儿的肠道菌群中占主导地位的是双歧杆菌和肠杆菌科，随着年龄的增长双歧杆菌的数量逐渐下降，成人肠道菌群中厚壁菌门和拟杆菌门为主导。不同人群的肠道菌群广度相同，菌群的大小和细菌数量不同。

实时荧光定量PCR技术除了应用于研究人体肠道微生物菌群之外，也很广泛的应用于动物肠道微生物的检测当中。Murray 等［13］利用高通量测序（High-throguhput sequencing，HTS）技术和实时荧光定量PCR技术分别定量鱼粪便中的DNA，两种方法测得的数据相似，通过设计4种种特异性鱼实时荧光定量PCR试验，得出的数据与相同样本下HTS得出的数据相比较，可以直接得出二者的优势和劣势，可为长期的粪便检查项目选择方法。Garcia等［14］采用实时荧光定量PCR技术直接精确的定量家禽粪便中弯曲杆菌，菌数可达2.7×106CFU/mL。该技术对于评估公共健康风险和评价家禽肠道中弯曲杆菌控制措施的有效性具有重要作用。

3 肠道微生物和疾病的相关研究

近年来，肠道微生物与疾病的相关研究成为热点，越来越多的研究发现疾病与肠道菌群的失衡有极大的关系，而实时荧光定量PCR技术凭借其快捷、精确等优点成为肠道微生物研究的有用工具。

我们将身体质量指数（Body mass index，BMI）大于30 kg/m2定义为肥胖，脂肪的大量堆积极大地提高了死亡率并且是引起包括糖尿病、高血压、呼吸系统紊乱、缺血性心脏病、中风和癌症等疾病的危险因子。肥胖是全球性流行病，在南美洲超过30%的人口肥胖。导致肥胖的原因很复杂，包括环境因素、基因因素、神经和内分泌因素［15-17］。近期，更多的研究将肥胖和肠道微生物菌群联系在一起。肥胖影响人体健康并且改变细菌性肠道微生物菌群，主要是拟杆菌的减少，但还没有发现属和种水平上的数据。已有报道称乳杆菌属和双歧杆菌属在调节体重方面扮演重要角色，在实验模型和人体中具有抵制肥胖的效果。Million等［18］通过实时荧光定量PCR技术和乳酸杆菌选择性培养基分析了68个肥胖人群和47个正常人粪便中的细菌（主要分析的细菌有厚壁菌、拟杆菌、史氏甲烷短杆菌、乳酸乳球菌、动物双歧杆菌和7个乳酸杆菌种），首次提供了乳酸杆菌属具体的一个种与人类肥胖相关联的数据。结果显示，动物双歧杆菌和史氏甲烷短杆菌与正常体重有关，而罗伊氏乳杆菌与肥胖有关，其中肥胖人群的肠道中史氏甲烷短杆菌数量减少。2011年，Everard等［19］深入和全面的分析调查了肥胖和糖尿病小鼠在摄入益生菌之后的肠道微生物菌群和生物参数。对基因诱导小鼠肠道微生物进行分析时用到了实时荧光定量PCR、16S rRNA焦磷酸测序和基因芯片技术。结果显示，摄入益生菌的小鼠的肠道中厚壁菌的数量减少，拟杆菌的数量增加，并且有102个细菌类群的数量发生变化。另外益生菌促进了葡萄糖耐受，增加了L-cell数量和相关参数，减少脂肪含量、氧化应激和低度炎症。

缺铁性贫血是全球性的健康问题，通常改善措施就是铁的营养强化和补充。铁不仅是人体必需，也是肠道细菌必不可少的。2012年，Dostal等［20］研究铁的缺失和充足对小鼠肠道微生物的影响。刚断奶的小鼠摄入缺铁性饮食24 d，之后的13 d补充充足的FeSO4或电解质铁，摄入量分别为10和20 mg Fe/kgdiet。另外，一组小鼠（n=8）只摄入缺铁性饮食；另一组小鼠（n=3）的饮食中有足够的铁（作为空白组），喂养37 d。利用时相温度梯度凝胶电泳和实时荧光定量PCR技术检测盲肠中微生物代谢组成和分析粪便中的微生物组成。与摄入足够铁的小鼠相比，缺铁的小鼠体内盲肠内的丁酸盐和丙酸盐浓度分别降低了87%和72%，乳酸杆菌和肠杆菌的数量增加，主要产丁酸的菌，如罗氏菌和直肠真杆

菌的菌数明显降低。在肠道末端，与缺铁小鼠相比，补充20 mg Fe/kgdiet显著增加盲肠中丁酸的浓度和部分细菌的数量。另外，在肠道微生物方面，补充FeSO4的效果要比补充电解质铁效果强烈。2013年，Dostal等［21］利用结肠模型接种固定的粪便微生物菌群进行体外发酵来研究Fe缺乏和Fe补充对儿童肠道复杂的微生物菌群的影响。通过实时荧光定量PCR、16S rRNA基因454焦磷酸测序和HPLC技术分析每日发酵液的微生物组成和代谢产物。高Fe和正常Fe的条件下不影响肠道微生物的组成和代谢物活性。与2012年试验结果一致，低铁条件下，罗氏杆菌、直肠真杆菌、拟杆菌降低了一个数量级，梭菌降低两个数量级，而乳杆菌和肠杆菌数量分别增加了两个数量级。在低铁环境条件下检测到主要的肠道菌群代谢产物降低，肠道微生物菌群严重失调，微生物菌群的屏障效应减弱，并对肠道健康产生负面影响。

实时荧光定量PCR技术除了应用于研究肠道微生物与肥胖和缺铁性贫血的关系之外，还涉及到其他方面的研究。Pärtty等［22］将94个早产儿随机分配，通过荧光原位杂交和实时荧光定量PCR技术检测其肠道微生物菌群。结果表明，与安静的婴儿相比，爱哭的婴儿肠道内乳杆菌、乳球菌、肠球菌和梭状芽孢杆菌的比例较高，婴儿双歧杆菌的菌数较低，分别为2.5×108CFU/mL和1.3×107CFU/mL。

4 小结

实时荧光定量PCR技术是目前发展起来的快速、精确定量核酸的最有效的方法之一。近几年实时荧光定量PCR技术广泛应用于肠道微生物、环境微生物、致病菌等的检测中，尤其在肠道微生物的相关研究中应用甚广。实时荧光定量PCR标准曲线的制作，引物、探针的设计是难点，因此在实验过程中对引物的设计、标曲的制作要求很严，同时在操作过程中增加平行避免人员操作对结果产生误差。实时荧光定量PCR技术具有很多优点：与传统的平板计数法相比，实时荧光定量PCR在无需体外培养的情况下即可对微生物进行定量，从而解决了未知微生物和不可培养的微生物的定量问题，并且具有工作量小、重现性高等优点；同时该技术可以定量样本中某一菌体的具体数量，而这一优点是宏基因组测序等测序技术无法实现的；实时荧光定量PCR对引物的设计要求很高，凭借其引物的特异性，该技术可定量到种的水平，与DGGE等传统分子技术相比，该技术具有其独特的优势；还有很多分子方法可用于目的核酸序列的定量，但这些方法都存在一些缺点，如费时费力、价格昂贵，有的需要使用放射性物质，有的容易交叉污染，而实时荧光定量PCR技术操作简便、快速、精确且具有高灵敏度和特异性强等优点，同时该技术是在全封闭状态下实现扩增及产物分析，有效地减少了污染及对人体的伤害。实时荧光定量PCR技术为肠道微生物领域的研究提供了便利。在微生物多样性研究当中，我们应该将实时荧光定量PCR技术与其他分子技术相结合，从而使实验结果更为精确可靠，并且提供更为全面深入的信息。

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（责任编辑 狄艳红）

Advances of Real-time PCR Technology in the Field of Gut Microbiota

Zhao Jie Ma Chen Xi Xiaomin Zhang Heping
（Key Laboratory of Dairy Biotechnology and Engineering，Ministry of Education，Inner Mongolia Agricultural University，Huhhot 010018）

Real-time PCR is one of the most effective methods, which rapidly accurate quantify nucleic acids. Compared with metagenomic, real-time quantitative PCR can quantify microorganism . Real-time PCR, a simple, fast, efficient, specific and high-throughput method, is widely used in the field of gut microbiology. The technology in studies of intestinal microbes and disease has a wide range of applications. This paper reviews research progress about real-time PCR in the field of intestinal microbial recent years.

Real-time PCR Gut microbiota Microbiota diversity

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2014.12.010

2014-05-04

农业部现代农业产业技术体系建设项目（CARS-37）

赵洁，女，硕士，研究方向：乳品生物技术与加工工程；E-mail：zhaojie19901021@sina.com

张和平，男，教授，博士生导师，研究方向：乳酸菌及发酵乳制品；E-mail：hepingdd@vip.sina.com