饲料中真菌毒素生物脱毒的研究进展

张晓琳 汪 洋 李爱科

(国家粮食局科学研究院，北京 100037)

真菌毒素(mycotoxins)是某些真菌在污染谷物或者食品的生长繁殖过程中，产生的具有毒害作用的次级代谢产物，由其引起的中毒症状被称作是真菌毒素中毒症状(mycotoxicoses)。目前，已经发现真菌毒素的种类达400多种，其化学、生物学和毒理学性质多种多样，主要的毒性作用包括致癌作用、遗传毒性、致畸作用、肝细胞毒性、中毒性肾损害、生殖紊乱和免疫抑制。真菌毒素的存在不仅给人类及牲畜的健康带来极大的危害，也造成了相应的经济损失。据联合国粮食与农业组织(Food and Agriculture Organization of the United Nations，FAO)统计，全球每年约有25%的农作物被真菌毒素污染，约2%的农作物因污染严重而失去营养和经济价值，造成数千亿美元的经济损失［1］。另外，2003年末至2004年秋，由于养猪行业大量使用发霉玉米，动物出现多种并发传染病，养殖场出现难以控制的局面。据调查，仅河南省死亡猪只就达1 000万头。如果以平均每头100元计算，经济损失达10亿元;如果再考虑饲料转化率低下、动物药品消耗增加，则2004年中国范围仅养猪业损失就在100亿元以上［2］。因此，如何解决真菌毒素对粮食和饲料的污染，对改善动物生产性能和提高人类食品安全有非常重要的意义。目前，毒素污染饲料的脱毒方法主要包括物理、化学和生物脱毒法。虽然物理、化学脱毒法取得了一定程度上的成功，但存在操作困难、降低饲料的营养品质和适口性等缺点［3-4］。与物理、化学脱毒法相比，生物脱毒法具有作用条件温和，对原料的感官性状、适口性等影响极小，增加原料营养价值等优点，被认为是最佳脱毒方法。随着物理、化学脱毒手段弊端的不断出现和人们对迅猛发展的生物技术优点的认识增加，国内外利用微生物进行毒素脱毒的研究正在逐步展开，而且相关研究成果表现出了良好的开发和应用前景。生物脱毒作用除了包括微生物通过酶促反应将毒素转化成低毒或者无毒产物的生物转化作用之外，还包括将毒素黏附在其细胞壁上形成复合物而达到去除毒素目的的吸附作用，后者通常不改变毒素分子本身的结构，不是本文阐述的重点。本文针对饲料中常见的真菌毒素，对近年来国内外真菌毒素生物脱毒的研究进展进行概述。

1 真菌毒素的生物脱毒

1.1 黄曲霉毒素(aflatoxin，AFT)

AFT是一类由多种寄生曲霉(Aspergillus parasiticus)和黄曲霉(Aspergillus flavus)产生的二呋喃氧杂萘邻酮的衍生物［5］，现已分离出 B1、B2、G1、G2、B2a、G2a、M1、M2、P1 等 18 种之多，其中以黄曲霉毒素B1(aflatoxin B1，AFB1)的毒性和致癌性最强。AFB1广泛存在于玉米、高粱、花生粉、豆粕、棉籽粕等饲料原料中，其危害包括降低动物产乳量及产蛋量，导致动物免疫力低下以及致癌、致畸和致突变。对AFT生物降解的研究较早，已发现多种真菌和细菌都具有降解AFT的能力。真菌中的树状指孢霉(Dactylium dendroide)［6］、少根根霉(Rhizopus arrhizus)［7］、寄生曲霉［8］、茎点霉(Phoma sp.)［9］、白腐菌(Trametes versicolor)［10］、黑曲霉(Aspergillus niger)［11］、假蜜环菌(Armillariella tabescens)［12］及食用真菌糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus)［13］都具有生物降解 AFT的作用。虽然这些真菌能够降解AFT，但是降解过程缓慢并且不彻底［6-13］，这在一定程度上限制了其在饲料行业中的应用。在20世纪末，国内研究者刘大岭等［12］首先发现假蜜环菌E-2的粗酶液可使样品中的AFB1含量减少80%;随后，该真菌产生的AFB1降解酶得以分离纯化［14］，其编码基因也得以成功克隆和表达［15］。另外，对该脱毒酶的固定化技术和酶特性研究表明，此脱毒酶的理想反应条件是中性pH，高水分的体外反应体系，比较适合在植物油、酱油、啤酒以及牛奶等液体反应体系中进行，难以在籽实、饼粕等低水分饲料原料中直接应用［16-17］。

细菌降解AFT的报道并不太多，Lillehoj等［18］首先发现橙色黄杆菌(Flavobacterium aurantiacum)具有去除溶液中AFT的能力。后来，Smiley等［19］研究发现橙色黄杆菌能产生一种脱毒酶，该脱毒酶通过酶促作用使AFT达到降解。Hormisch等［20］从煤田附近污染的土壤样品中分离到1株能够同时降解荧蒽和AFB1的分支杆菌(Mycobacterium fluoranthenivorans)。Teniola 等［21］也从多环芳烃化合物污染的土壤中分离得到红串红球菌(Rhodococcus erythropolis)DSM 14303和分支杆菌DSM 44556T，它们分泌的胞外酶都具有较高的降解AFB1的能力。Alberts等［22］通过薄层色谱-高效液相色谱-电喷雾质谱-液相质谱技术，对红串红球菌降解AFB1的机理进行了进一步研究，结果表明该菌对AFT的消减是由于其产生的酶的生物降解作用。另外，李俊霞等［23］以香豆素为唯一碳源和能源进行初筛，以AFB1为唯一碳源和能源进行复筛，获得1株嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonas sp.)，该菌株对 100 μg/kg的AFB1的72 h的降解率达到85.7%。

1.2 赭曲霉毒素(ochratoxin，OT)

OT是由曲霉属(Aspergillus)和青霉属(Penicillium)中的某些菌株产生的具有毒害作用的次级代谢产物。OT是污染谷物食品与饲料的重要真菌毒素，共有A、B、C和α4种衍生物，其中毒性最大、与人类健康关系最密切、产毒量最高、对农作物的污染最重、分布最广的是赭曲霉毒素A(ochratoxin A，OTA)。OTA能对肾脏和肝脏产生损伤作用，具有致畸性、致癌性和免疫毒性等多种毒性，对动物和人体健康有很大的潜在危害。OTA由异香豆素通过酰胺键与β-苯丙氨酸相连形成。OTA分子结构中的苯丙氨酸基团是其毒力基团［24］，其生物降解通常是将OTA水解为低毒的赭曲霉毒素 α(ochratoxinα，OTα)和 β-苯丙氨酸［25］。在细菌降解OTA方面，研究显示动物的胃肠道微生物通常能有效地降解OTA，特别是在反刍动物中［26-27］。Madhyastha 等［28］研究发现，非反刍动物肠道内的微生物也能影响OTA的生物降解率，OTA的降解率可能与盲肠和大肠中微生物的多少有关。Hwang等［29］对37种细菌进行筛选后发现，醋酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)能在乙醇无机盐培养基中将OTA降解为OTα。Fuchs等［30］筛选到 1 株嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)VM20可以降解OTA，并且通过人类肝肿瘤细胞微核试验对该菌株的脱毒效果进行了生物学验证。Petchkongkaew等［31］从泰国发酵大豆产品中分离到的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)CM21对 OTA的降解率达到92.5%，其中的降解产物之一是OTα，其降解机制可能是该菌株产生的羧肽酶(carboxypeptidases)的酶促分解作用。短杆菌属(Brevibacterium)细菌同样具有降解OTA的能力，降解产物为OTα和L-β- 苯基丙氨酸［32］。Shi等［33］从新鲜的麋鹿粪便中分离到的1株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CW14，该菌株不仅能够抑制 OTA产生菌——曲霉菌的生长，还具有高效降解OTA的能力。Böhm等［34］报道，乳酸杆菌(Lactobacillus)、芽孢杆菌(Bacillus)、酵母菌(Saccharomyces)都具有一定的OTA降解能力，但降解产物的结构、毒性以及这些微生物在毒素污染饲料中的实际应用效果都有待进一步研究。某些真菌如烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、黑曲霉(Aspergillus niger)、匍枝根霉(Rhizopus stolonifer)TJM8A8和小孢根霉(Rhizopus microsporus)NRRL2710都具有降解OTA的能力［35-36］。除了霉菌之外，Péteri等［37］发现红发夫酵母(Phaffia rhodozyma)CBS 5905不仅能吸附OTA，还能通过羧肽酶将OTA降解为低毒的OTα。

1.3 玉米赤霉烯酮(zearalenone，ZEN)

ZEN ，又称F2毒素，是一种具强烈致畸作用的生殖系统毒素。ZEN能导致家畜生长速度下降、免疫抑制、繁殖障碍等。近年来，对ZEN生物降解的研究取得了一定进展。据报道，粉红螺旋聚孢霉(Clonostachys rosea)IFO 7063可以通过分泌碱性水解酶——泛解酸内酯水解酶，将ZEN转化成无雌激素性质的产物，水解酶编码基因zhd101也已经被成功克隆和表达［38-39］。Molnar等［40］从白蚁的后肠中分离出了1种新酵母菌——解毒毛孢酵母(Trichosporon mycotoxinivorans)，它可以成功地将1 mg/L的ZEN降解成无毒的非雌激素类化合物。Altalhi等［41-42］研究发现恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)ZEA-1具有降解ZEN的能力，编码此ZEN降解酶的基因在大肠杆菌中也获得了表达。另外，一些根霉菌，如匍枝根霉(Rhizopus stolonifer)、米根霉(Rhizopus oryzae)、小孢根霉(Rhizopus microsporus)，也具有降解ZEN的能力［36］。国内近几年在ZEN降解菌株筛选和基因克隆方面也取得了一些研究进展。程波财等［43］通过富集分离的方法获得了1株藤黄微球菌(Micrococcus luteus)，该菌株能将2μg/mL的ZEN几乎完全降解;该课题组研究人员又从粉红螺旋聚孢霉中克隆到与zhd101高度同源的基因ZEN-jjm，并在大肠杆菌中成功表达［44］。刘海燕等［45］从粉红螺旋聚孢霉31535菌株中克隆了与zhd101有11个碱基差异的基因zlhy-6，并在毕赤酵母中成功表达。Yu等［46］从土壤中分离了 1株不动杆菌(Acinetobacter sp.)SM04，该菌株能在以 ZEN为唯一碳源和能源的培养基中快速生长，并能将ZEN降解成无毒的非雌激素类化合物，进一步研究发现其发酵上清液中的过氧化物酶具有降解ZEN的功能，其编码基因也得以成功克隆和表达［47］。

1.4 脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)

DON，化学名称为 3α，7α，15- 三羟基 -12，13-环氧单端孢霉-9-烯-8-酮，因能引发母猪拒食和呕吐又得名呕吐毒素(vomitoxin)，它广泛存在于小麦、大麦、玉米等谷物类粮食和饲料中，家畜食用DON污染的饲料会引起拒食、呕吐、生长延迟、生殖紊乱等症状;而人类误食DON污染的粮食会引起免疫抑制、贫血、头痛、呕吐、厌食和腹痛等症状［48-51］。对DON生物脱毒的研究始于20世纪80年代，迄今为止，国内外已经报道的DON生物脱毒方式主要包括C3羟基的乙酰化、糖苷化、氧化、异构化，C16的羟基化，C12/C13环氧基团的去环氧化。在DON的化学结构中，12，13-环氧基团是主要的毒力基团，去掉这个基团可以大大地降低其毒性，肠道微生物菌群可以通过酶促降解环氧基团从而对DON起到减毒作用。Fuchs等［52］从牛瘤胃的富集培养物中分离到真杆菌(Eubacterium)BBSH 797，该菌可以在24～48 h内转化DON和其他的单端孢霉烯族毒素，从而部分地降低饲料中毒素的毒力，后来，百奥明公司基于此脱毒机理成功开发了微生物饲料脱毒制剂真杆菌BBSH 797，表明了其良好的应用价值，但由于该脱毒方式需要严格的厌氧条件，一定程度上限制了其应用。Shima等［54］从土壤中分离到1株属于土壤杆菌-根瘤菌属(Agrobacterium-Rhizobium)的细菌E3-39，它能够在培养l d后把90%的DON转化为3-酮基-DON，从而使DON在免疫抑制方面的毒性大大降低。Ikunaga等［54］在土壤中筛选到1株诺卡氏属菌株，该菌株能在好氧条件下利用DON为唯一碳源和能源生长，其降解毒素浓度范围为10～1 000μg/mL。He等［55］通过高浓度的DON作为选择性压力，从南京郊外土壤中分离得到1株可以水解DON的塔宾曲霉(Aspergillus tubingensis)，该菌株与 DON共培养14 d后，可清除 94.4% 的 DON。徐剑宏等［56］从土壤、麦穗中分离获得了1株德沃斯氏菌(Devosia sp.)DDS-1，该菌株对液体培养基中DON的降解率达95%以上，其代谢产物化学结构及其毒性未知。后续研究发现德沃斯氏菌DDS-1可以先将DON乙酰化为3-乙酰基-DON，然后再将3-乙酰基-DON氧化为3-羰基-DON，接下来再进一步降解;对3-乙酰基-DON氧化酶的酶学特性研究表明，德沃斯氏菌DDS-1产生的3-乙酰基-DON氧化酶具有较好的温度和酸碱稳定性，该酶反应需要金属离子作为辅因子［57］。

1.5 伏马毒素(fumonisin，FB)

FB主要是由串珠镰刀菌(Fusarium moniliforme)、层出镰刀菌(F.proliferatum)、轮枝镰刀菌(F.verticillioides)等有害真菌感染玉米及其他农作物产生的一类结构相似的真菌毒素。到目前为止，已经发现24种FB，其中有明显毒性且含量较高的是伏马毒素B1(fumonisin B1，FB1)、伏马毒素B2(fumonisin B2，FB2)和伏马毒素 B3(fumonisin B3，FB3)，而FB1则是危害性最大和研究最广的FB［58］。FB作为动物饲料中常见的真菌毒素之一，对各种动物的影响不一，它能引起马脑白质软化症(equine leukoencephalomalacia，ELEM)、猪肺水肿等疾病，给多种动物肝脏、肾脏造成损伤，甚至引起肿瘤发生，且人食管癌和神经管型缺陷病也可能与FB有关，对畜禽和人类的健康造成很大的危害。最近，国际癌症研究机构(International Agency for Research on Cancer，IARC)已将它列入可能致癌物的黑名单内。目前，许多先进国家为了保护国民健康及畜牧业不受其害，已开始着手制定农产品及其食用原料等有关于FB的限量标准，并管制已受此毒素污染的食品不得流入消费市场。关于FB的生物降解研究报道并不多见，其原因可能是由于该毒素发现时间较晚，对其危害性认识不够且未引起足够重视。据报道，斯平尼弗外瓶柄霉(Exophiala spinifera)可以以FB1为唯一碳源生长，进一步研究表明该菌株产生的可溶性酯酶、胺氧化酶和其他酶可作用于FB进行一系列的酶促反应，从而达到降解毒素的目的［59-60］。

2 真菌毒素生物脱毒研究中存在的问题

生物脱毒作为真菌毒素脱毒研究领域的热点，已经有诸多研究成果见诸报端，但这些研究成果大都停留在基础研究阶段，离规模化推广应用仍有一定的距离。从基础和应用方面综合考虑，生物脱毒的研究仍然存在以下几个关键问题有待深入研究与探索。

2.1 降解菌株方面

其一，有些毒素降解菌株的毒素降解能力不太理想，存在着降解不彻底、活性容易消失等问题。上文提及的从土壤中分离到的细菌Agrobacterium-Rhizobium E3-39，能将DON氧化为中间产物3-酮基-DON后将之同化［53］，但从该篇文章报道至今近20年的时间内，未见任何后续报道，猜测其活性已经丧失。其二，降解菌株本身缺乏毒性评估，其结果会最终决定降解菌种本身是否具有实质性的应用价值。其三，对真菌毒素生物解毒的研究主要侧重于对降解单一毒素菌株的筛选，在自然条件下，真菌毒素的产生通常具有共发性，即2种或多种毒素共同存在，而这些毒素被动物误食之后，其毒性作用具有协同性，会对动物的健康产生更大的危害。目前，真菌毒素生物降解的研究多侧重于对单一毒素降解菌株的筛选，而对于具有多种毒素降解能力菌株的筛选研究则相对较少，需进一步加大研究力度。其四，筛选过程中，真菌毒素标准品通常是作为唯一碳源加入到培养基当中，而标准品价格不菲，这无疑增加了不少的研究成本。有研究人员在AFB1降解菌株初步筛选的研究中，以AFB1结构类似物——香豆素来替代价格昂贵的AFB1标准品［23］，不但经济可行，还减少了研究人员与黄曲霉毒素的接触，安全性高，这种研究方法希望能给同行带来一些启发。

2.2 降解机理方面

其一，真菌毒素作为化学性质稳定、结构复杂的小分子物质，它的生物降解过程通常需要多种酶共同作用，经过多个生化反应完成，在此过程中产生的中间产物和终产物是否真正的低毒或者无毒?这些代谢产物被动物食用的时候，会不会被动物自身或其消化系统内的微生物重新代谢生成有毒有害的物质?这些方面都需要生物脱毒科研工作者给予充分的重视，并加强这方面的研究。其二，真菌毒素生物脱毒的一般性研究主要是侧重于降解菌株的筛选和菌株的降解能力，但是对于降解酶的分离、纯化，降解酶蛋白质结构、序列及降解酶基因克隆等作为生物脱毒开发应用的重要理论基础研究则很薄弱，仍需深入系统化研究。

3 小结

真菌毒素作为一类无法完全避免的剧毒性天然污染物，由于其存在的广泛性、毒害性，如何有效控制真菌毒素污染一直是粮食和饲料行业悬而未决的难题。真菌毒素的生物脱毒作为一种安全、高效、环保的方法备受研究者的关注。虽然现在国内外利用生物脱毒以降解饲料中真菌毒素的应用少之又少，但现有的研究成果均表现出了良好的开发和应用前景，相信在不久的将来，越来越多的真菌毒素降解菌株和降解酶会被人们发现，各种未知的毒素降解机制也将逐渐为人类所了解和掌握，更多的真菌毒素微生物脱毒剂或脱毒酶制剂产品被成功应用于粮食和饲料行业，从而提高粮食利用率，保证畜牧业的安全生产，提高畜牧业经济效益。

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