5－ALA－PDT对人皮肤鳞状细胞癌A431细胞的抑制作用

刘 瑶王逸飞张春敏∗张春红魏 国孙 静刘园园

5－ALA－PDT对人皮肤鳞状细胞癌A431细胞的抑制作用

刘 瑶1王逸飞2张春敏1∗张春红1魏 国1孙 静3刘园园1

目的: 确定5－ALA－PDT对人皮肤鳞状细胞癌A431细胞的抑制作用。方法: 用5－ALA与A431细胞共同孵育，经630 nm红光照射后，采用MTT法检测细胞生长的抑制率，确定培育时间、5－ALA浓度及光照剂量对皮肤鳞状细胞癌A431细胞的抑制作用。结果: 当光照剂量为80 J/cm2和5－ALA浓度为3.2mmol/L，5－ALA与A431细胞共同孵育120 min时，抑制率最大。结论: 5－ALA－PDT对体外培养的A431细胞的增殖有明显抑制作用。

5－ALA； 鳞状细胞癌

皮肤鳞状细胞癌(squamous cell carcinoma，SCC)是起源于表皮角质形成细胞的一种恶性肿瘤，具有病因复杂、临床误诊率高、恶性程度大及侵袭性和破坏性强等特点。1目前皮肤鳞癌的治疗方法有手术切除、放射治疗、外用药物治疗及光动力治疗等。光动力疗法(Photodynamic therapy，PDT)又被称为光辐射疗法(Photoratiation Therapy，PRT)或光化学疗法(Photochemotherapy)，是一种正在研究中的、治疗某些体表良恶性病变的有效方法，它是由光能激发光敏剂后引起的一种光化学反应，可选择性地破坏生物组织，部分成果已经应用于临床。2

5－氨基酮戊酸－PDT(5－ALA－PDT)治疗SCC的资料并不多。本研究采取MTT法检测5－ALA－PDT对体外培养的A431细胞的杀伤作用，目的是为临床应用5－ALA－PDT治疗皮肤鳞状细胞癌提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞来源 人皮肤鳞状细胞癌A431细胞购自协和医科大学基础医学研究所细胞中心。

1.1.2 主要试剂 DMEM培养液(Hyclon公司)，胎牛血清(杭州四季青生物工程有限公司)，胰蛋白酶(Hyclon公司)，MTT(sciencell公司)，DMSO(北京索莱宝科技有限公司)。

1.1.3 主要仪器 倒置光学显微镜(日本奥林帕斯CK40)，超净工作台(苏州苏净集团安泰公司)，二氧化碳孵箱(新加坡ESCO)，紫外分光光度计(英国Biochrom)，光动力仪器(桂林兴达光电医疗器械有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 在37℃、含5%CO2及饱和湿度的孵箱中，用含10%胎牛血清的DMEM(高糖)培养HaCaT细胞及人皮肤鳞癌A431细胞，每2天更换培养液1次。实验选用对数生长期的细胞。

1.2.2 MTT检测 (1)取对数生长期的A431细胞，胰蛋白酶消化后，用含10%小牛血清的DMEM培养基配成浓度为4×105/mL细胞悬液；(2)接种在96孔培养板，每孔200μL，每组设9个复孔，分为空白组(调零)、实验组(6组)和阴性对照组(不加药物的细胞)，在37℃，5%CO2饱和湿度条件下培养24 h，待细胞完全贴壁后进行PDT处理；(3)弃去上清液，用PBS洗3次，然后每孔加入20μL含MTT的无血清培养基，37℃再培养4 h；(4)弃上清液，每孔加150μL DMSO震荡溶解10 min，使紫色结晶完全溶解，在酶联免疫检测分析仪570 nm处测定各孔吸光度值OD值，重复3次，取3次结果的平均值。细胞生长抑制率＝[1－(实验组OD值/对照组OD值)]×100%；(5)光敏剂5－ALA用无血清的DMEM培养基配制成0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4 mmol/L浓度的工作液；(6)5－ALA本身对A431细胞的影响:同上法将细胞接种于96孔板，每组加入5－ALA浓度分别为0(对照组)、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4 mmol/L，不照光；(7)单独光照剂量对A431细胞的影响:同上法将细胞接种于96孔板，不加入5－ALA，进行照光，光照剂量分别为0 (对照组)、20、40、60、80、100、120 J/cm2；(8)培育时间对PDT效果的影响:同上法将细胞接种于96孔板，分别于照光前30 min、60 min、90 min、120min、150 min、180min加入5－ALA，使得每孔浓度为3.2mmol/ L，光照剂量为80 J/cm2；(9)5－ALA浓度对PDT效果的影响:同上法将细胞接种于96孔板，每组5－ALA浓度分别为0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4 mmol/L。置培养箱培育120 min后照光，光照剂量为80 J/cm2；(10)光照剂量对PDT效果的影响:同上法将细胞接种于96孔板，加入5－ALA浓度为3.2 mmol/L，孵育时间为120 min，光照剂量分别为20、40、60、80、100、120 J/cm2进行照光。

1.3 统计学方法 实验数据用SPSS 19.0软件处理，生存期及抑制率以¯x±s表示，行单向方差分析(F检验)，P＜0.05为有统计学差异。

2 结果

2.1 单独照光及单独加药对A431细胞并无抑制或促进其生长作用。

2.2 光照剂量(80 J/cm2)和5－ALA浓度(3.2 mmol/ L)不变时，5－ALA处理A431细胞的时间在30～120 min内，抑制率随时间的增加而升高。在120～180 min内升高趋势不明显(表1、图1)。

2.3 光照剂量(80 J/cm2)和培养时间(120 min)不变时，5－ALA浓度在0.2～3.2 mmol/L范围内，随着浓度的增高，抑制率升高明显。在3.2 mmol/L和6.4 mmol/L两个浓度时，细胞抑制率无明显变化(表2、图2)。

2.4 培养时间(120 min)和5－ALA浓度(3.2 mmol/ L)不变时，光照剂量在20～80 J/cm2范围内，抑制率逐渐升高。在80～120 J/cm2范围内，无明显差异(表3、图3)。

图1 5－ALA与A431培育时间对A431细胞的抑制作用

图2 不同浓度的5－ALA对A431细胞的抑制作用

图3 不同光照剂量对A431细胞的抑制作用

表1 5－ALA与A431培育时间对A431细胞生长的抑制率

表2 不同浓度的5－ALA对A431细胞的抑制率

表3 不同光照剂量对A431细胞生长的抑制率

3 讨论

SCC是表皮角质形成细胞异常增生而形成的一种恶性肿瘤，多发生在皮肤与黏膜交界及皮肤暴露部位，如颊、鼻、额部、下唇、外生殖器、眼睑下、外耳等。3SCC的发生与多因素有关，涉及感染、物理、遗传、化学等多种因素。4－6

SCC治疗方法很多，但手术治疗仍是一线治疗方法。7自1990年Kennedy将5－ALA－PDT试用于临床后，其在皮肤科的领域得到广泛应用，获得满意的效果。其安全、高效等独特优点使之成为国内外研发和应用的热门领域之一。8，95－ALA－PDT具有良好的美容效果，特别是解剖部位特殊的肿瘤。8

有资料报道，10经2次ALA－PDT后Bowen’s病(BD)、日光性角化病(AK)和基底细胞癌(BCC)的完全缓解率(CR)分别为88%、99%和95%，12个月后的CR分别为69%、72%和82%。最近，许多学者报道了关于ALA－PDT应用于各种肿瘤细胞的疗效，有学者为了研究ALA－PDT对于口腔鳞癌及喉癌的疗效，分别对两组患有口腔鳞癌的患者进行了治疗，其中一组单独进行ALA－PDT治疗，经过96个月随访发现，5年的治愈率达90%，另外一组利用ALA－PDT与5－氟尿嘧啶联合治疗，最长随访达211个月，5年治愈率达100%，且ALA－PDT疗法可以保留正常组织用来说话和吞咽。11国外有学者报道300例患有头颈部鳞癌的患者接受ALA－PDT治疗后，成功治愈，5年复发率为85%。12国内颉玉胜等13对30例皮肤鳞状细胞癌进行了4～11次ALA－PDT治疗，并与经手术治疗的30例患者进行复发率的比较，治疗效果虽无差异，但光动力组美容效果满意。

我们用不同的方式干预A431细胞后，通过MTT检测各组细胞抑制率，发现单独用药和单独照光对细胞生长基本无影响；在相同的光照剂量和培养时间下，随着5－ALA浓度的递增细胞抑制率呈上升趋势，但在3.2～6.4 mmol/L这两个浓度之间，细胞抑制率上升不明显，抑制作用进入平台期，提示并非光敏剂浓度越高对A431细胞抑制作用越强；同时，培养时间和5－ALA浓度相同时，光照剂量在80～120 J/cm2范围内，抑制作用亦进入平台期，细胞生长抑制率上升亦不明显。以上结果表明ALA－PDT对体外培养的皮肤鳞癌细胞有明显的杀伤力，同时提示为了在副反应最小的条件下达到最好的杀伤效果，我们应选择适当的PDT参数。对于体外培养人皮肤鳞状细胞癌A431细胞，在5－ALA浓度为3.2 mmol/L，光照剂量为80 J/cm2，培育时间为120 min时，5－ALA－PDT的抑制作用最强，这为临床应用5－ALA－PDT治疗SCC提供一定的理论和实验室依据。

国内外研究可以说明ALA－PDT对肿瘤有一定的疗效，同时我们的研究结果说明ALA－PDT对体外培养的皮肤鳞癌细胞有明显的抑制生长的作用，而且目前临床上已经广泛应用ALA－PDT来治疗多种皮肤疾病和皮肤癌，但对皮肤SCC的疗效存在争议，相关资料显示，ALA－PDT对于SCC的治疗，效果并不理想，复发率高达50%以上。14，15Bexfield用ALAPDT治疗猫的皮肤浅表性鳞状细胞癌一次后治愈率为85%，Ferreira用ALA－PDT治疗12例猫的皮肤鳞状细胞癌，却有7例侵袭性鳞状细胞癌治疗1～2次后无反应。我们在临床治疗中也发现ALA－PDT对于部分SCC的疗效不够理想，何种原因导致ALA－PDT对不同皮肤疾病治疗作用不同，是否ALA－PDT对不同分化程度或不同期别SCC作用不同尚不清楚，分析原因可能除与激光的穿透深度、光敏剂的剂量、渗透深度有关外，主要是ALA－PDT对肿瘤细胞的杀伤能力起着关键性作用，这将是我们下一步研究的重点。

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14 Braathen LR，Szeimies RM，Basset－Seguin N，et al.Guidelines on the use of photodynamic therapy for nonmelanoma skin cancer:an international consensus.International Society for Photodynamic Therapy in Dermatology，2005.J Am Acad Dermatol，2007，56:125－143.

15Nestor MS，Gold MH，Kauvar AN，et al.The use of photodynamic therapy in dermatology:results of a consensus conference.Drugs Dermatol，2006，5:140－154.

(收稿:2014－01－08 修回:2014－03－06)

The inhibitory effects of 5－ALA－PDT on human skin squamous cell carcinoma A431 cells in vitro

LIU Yao，WANGYi-fei，ZHANGChun-min，etal.The Second Hospital ofShandong University，Jinan，250033

Objective:To determine the inhibitory effects of 5－ALA－PDT on human skin squamous cell carcinoma(SSC)A431 cells in vitro.Methods:After 5－ALA were co－incubated with SCC A431 cells and were irradiated with a 630 nm red light，the inhibitory effectwasmeasured by MTT assay.The effects of coincubation time，concentration of 5－ALA and light doses on the inhibitory rates were determined.Results: The inhibition rate reached themaximum value when 80 J/cm2light dose，3.2 mmol/L 5－ALA and 120 m in co－incubation time were used.Conclusion:5－ALA－PDT can significantly inhibit human SSC A431 cells.

5－ALA；squamous cell carcinoma

山东省科技发展计划项目(编号:2009GG10002026)

1山东大学第二医院皮肤科，济南，250033

2山东大学医学院，济南，250012

3山东中医药大学，济南，250355

∗通信作者