长脉冲Nd:YAG 1064 nm激光对红色毛癣菌生长及超微结构的影响

禚风麟 张蕊娜 王 莉 赵俊英

·论著·

长脉冲Nd:YAG 1064 nm激光对红色毛癣菌生长及超微结构的影响

禚风麟 张蕊娜 王 莉 赵俊英∗

目的: 确定长脉冲Nd:YAG 1064 nm激光对临床分离红色毛癣菌Y生长及超微结构的影响。方法:长脉冲Nd:YAG 1064 nm激光以200 J/cm2、400 J/cm2、600 J/cm2能量体外照射含有等菌量的红色毛癣菌Y菌落，观察照射后菌落生长的变化，同时将激光照射前后的菌落制备成标本，分别用扫描电镜及透射电镜观察其超微结构变化。结果: 长脉冲Nd:YAG 1064 nm激光能量为400 J/cm2时，可抑制红色毛癣菌Y菌落的生长，600 J/cm2时，红色毛癣菌Y菌落停止生长。激光照射后的红色毛癣菌Y菌落，在扫描电镜下菌丝结构由光滑变为粗糙，延长变为皱缩、截短，膨大；透射电镜下菌体细胞壁及细胞器结构破坏，可见髓样小体及蛋白凝固体。600 J/cm2处理组:菌体崩解、坏死。结论:长脉冲Nd:YAG 1064 nm激光可抑制或终止红色毛癣菌菌落的生长，改变菌体的超微结构。

长脉冲Nd:YAG 1064 nm激光； 红色毛癣菌Y

甲真菌病是皮肤科常见病，我国发病率为3%～5%。1甲真菌病影响美观，具有传染性，给患者的生理和心理带来负面影响，受到关注。甲真菌病由皮肤癣菌、非皮肤癣菌及酵母菌等真菌引起，其中红色毛癣菌(Trichophyton rubrum，T.rubrum)是最常见的致病菌，其临床分离率高达90%。激光治疗甲真菌病是近年发展的一种新疗法，尤其适用于老年人、儿童、肝肾功能不全、免疫功能低下的病人，受到国内外学者的重视，但其治疗方案和作用机制尚不清楚。本研究通过不同能量长脉冲Nd:YAG 1064 nm激光体外照射红色毛癣菌菌落，观察长脉冲1064 nm激光对红色毛癣菌生长和超微结构的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 受试的红色毛癣菌菌株Y(T.rubrum Y)分离自患者激光治疗前的病甲，激光治疗后该病甲有新甲长出，病甲达临床痊愈，激光治疗有效，此分离株经改良Kane/Fishcher系统鉴定为红色毛癣菌，菌落表型为绒毛型，我们将其命名为红色毛癣菌菌株Y。

1.2 仪器和设备 沙氏琼脂培养基(Sabouraud Dextrose Agar，SDA)购自青岛海博生物技术有限公司；透射式电子显微镜(Philip，NED)，扫描式电子显微镜(Hitachi，JPN)。PinpointeTMFootlaserTM长脉冲治疗仪(Nd:YAG 1064 nm激光治疗仪)由北京世纪广通生物科技有限公司提供。

1.3 方法 ①菌落的制备:临床分离的T.rubrum Y经接种活化后，取适量菌落用生理盐水配制成菌悬液，用无菌纱布滤过得孢子悬液，比浊仪比浊至0.5麦氏浊度，用移液器取20μL分别接种于8个SDA培养盘中央，28℃培养9天，形成一定大小的菌落备用。②实验分组:将上述8个已培养9天的SDA培养盘，每4个为一套，共2套，每套包括未照光组(对照组)、激光能量200 J/cm2组，400 J/cm2组、600 J/cm2组。③激光照射能量及方法:PinpointeTMFootlaserTM长脉冲治疗仪(Nd:YAG 1064 nm激光)以200 J/cm2、400 J/cm2、600 J/cm2对上述两套培养皿菌落进行垂直照射，光斑直径为3mm，脉宽30ms。脉冲频率为1 Hz。未照激光组为平行对照组。照光时激光头距离平皿约5 cm。激光束照射整个菌落，以螺旋状移动，从周围直至中心。每个菌落照射25～30个光斑，如此反复照3次。④生长曲线测定:其中一套培养皿于激光照射前即刻(作为第1天)、照射后放回培养箱继续培养，于第2～9天，用相机拍摄菌落大小(培养盘放置于坐标纸上，方便计数)，之后用Photoshop 7.0软件打开菌落图像，分别计数菌落所占的像点数和坐标纸小方格的像点数，二者之比乘以小方格的面积即为菌落生长的面积，未照光组作为对照组，分别计算每株菌的未照光组和不同能量激光照射组的菌落生长面积。此试验重复3次。⑤超微结构检测:a.扫描电镜样品制备及观察:从另一套激光照射后及未照射培养皿中分别挑取一小块菌落，置于无菌的1.5 mL离心管中，4℃冰箱中以3%戊二醛固定2 h，PBS溶液洗3次，每次20 min，再浸泡于1%锇酸溶液中，4℃下2 h左右；用30%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、100%乙醇各脱水20 min，丙酮脱水3次，每次20 min，临界点干燥，真空镀膜，扫描电镜观察。b.透射电镜样品制备及观察:样品的固定、脱水处理等步骤同扫描电镜，脱水处理后，环氧树脂Epon812包埋，超薄切片，醋酸铀和柠檬酸铅染色，透射电镜观察。

2 结果

2.1 长脉冲Nd:YAG 1064 nm激光照射对T.rubrum Y菌落生长的影响 记录红色毛癣菌Y菌落于激光照射前即刻(第1天)及各能量激光照射后第2～9天的菌落面积，将菌落面积统计分析如表1所示，并绘制成生长曲线(图1)。激光照射能量200 J/cm2时生长曲线几乎与对照组生长曲线重合；激光照射能量400 J/cm2时，菌落生长曲线较对照组生长曲线下移，且在第9天时，菌落生长面积又恢复至与对照组相似；激光照射能量600 J/cm2时，照射后即刻，菌落面积减小，第2～9天，菌落生长面积不变，生长曲线呈直线趋势，菌落停止生长。

图1 不同能量激光照射对T.rubrum Y菌落生长的影响

2.2 激光照射对T.rubrum形态结构的影响 T. rubrum Y菌落未照光时，在扫描电镜下菌丝形态规则，粗细均匀、笔直细长，表面光滑饱满，顶端和局部无膨大。透射电镜下，菌丝横切面超微结构显示菌丝壁为完整的双层膜结构，胞质密度均匀，内见线粒体、粗面内质网等细胞器。激光照射T.rubrum Y菌落后，扫描电镜下，随着激光照射能量的增加，菌丝表面变粗糙，可见大小不等的凹陷，菌丝萎缩、皱瘪，局部可形成膨大(图2)。透射电镜下，随着激光照射能量的增加，菌丝横切面超微结构显示菌丝双层细胞壁结构不完整，胞质密度不均，细胞器结构模糊或溶解，可见空泡化、脂滴、髓样小体、蛋白凝固体等，最后菌体可崩解、坏死(图3)。

表1 不同能量激光照射前后T.rubrum Y的菌落面积

图2 T.rubrum Y在不同能量激光处理组扫描电镜下菌丝结构(SEM，×8000)

图3 T.rubrum Y不同剂量激光处理组透射电镜(TEM)下菌丝横切面超微结构(×50 000)

3 讨论

基于传统口服抗真菌药的肝肾毒性及耐药率增高等弊端，近年来，国内外学者尝试应用紫外线、光动力或激光治疗作为甲真菌病的一种替代或补充治疗。但紫外线照射治疗有诱发照射部位基因突变的潜在危险性，限制了其应用。2光动力疗法需要将光敏剂外涂于甲板3～5 h后照光，治疗时间长，操作复杂，患者依从性差。3近红外线激光因波长较长，穿透力强，能量高，操作方便，治疗时间短(每个病甲需要几分钟)，无诱发基因突变等优点得到了学者们的认可。国外多项研究已证实激光治疗甲真菌病取得了较好的疗效。4，5我们的前期临床研究中，长脉冲Nd:YAG 1064 nm激光治疗127例病甲，6个月随访总有效率约为60%。6

但激光治疗甲真菌病的机制不清，目前依据各种激光在临床应用的探索，推测的可能机制主要包括7: (1)热剥脱及热分解效应:真菌细胞壁某些色素基团可吸收特定波长的激光，将光能转变成热能，色素基团崩解或气化，从而破坏真菌细胞壁结构，菌体凋亡，达到治疗目的；(2)热休克致蛋白变性:通常多种真菌在特定温度下(如超过40℃)可发生热休克，某些蛋白变性或失活，这种热效应反复持续刺激，最终达到抑菌或杀菌的效应；(3)活性氧簇(Reactive oxygen species，ROS)的氧化及细胞毒性作用；(4)激光对真菌的机械损伤作用。本研究中，长脉冲Nd:YAG 1064 nm激光体外照射临床分离的T.rubrum Y菌落后，菌落在200 J/cm2处理组，菌落生长曲线与未行激光照射的对照组生长曲线几乎重合，表明200 J/cm2激光能量不足以抑制T.rubrum Y菌落的生长。400 J/cm2处理组，T.rubrum Y菌落生长曲线较对照组生长曲线下移，说明可抑制T.rubrum Y菌落的生长。值得注意的是，激光照射后第2～8天菌落生长曲线下移，但至第9天时，菌落生长曲线上移至与对照组基本相同，这也许说明激光对T.rubrum Y菌落的抑制效应可持续约1周，这种抑制效应停止后，菌落可恢复正常生长。也为临床工作中，病人激光治疗间隔时间为1周提供了依据。Vural等8用几种不同波长的激光对临床分离的T.rubrum菌落进行体外照射，发现Q开关Nd:YAG 1064 nm和Q开关Nd:YAG 532 nm激光对T.rubrum菌落生长具有抑制作用，我们的研究结果与此文献报道一致。600 J/cm2处理组，照射后即刻，菌落周围碳化，颜色变黑，照射后即刻菌落面积缩小，说明当激光能量足够大时，菌体发生了热剥脱及热崩解效应，残余菌落面积维持不变，菌落停止生长。菌落停止生长的原因有两种可能:①激光能量高，直接杀灭真菌，菌体坏死。②高能量激光作用于培养基，使培养基变性，不能提供真菌生长所需营养，导致菌体死亡。基于我们在电镜检测菌丝超微结构变化时，是将激光作用菌体后即刻标本固定于3%戊二醛溶液中，因此可保留激光作用菌体后菌体即刻的形态结构，结合600 J/cm2时，SEM和TEM下菌体表现为坏死，故考虑激光破坏真菌结构，使菌体停止生长的可能性大。我们前期的临床治疗中，接受治疗的病人病甲应用的激光能量为288～324 J/cm2，上述体外实验表明此激光能量为抑菌剂量，因此病人病甲治愈可能与患者连续4～8周每周接受1次治疗，抑菌效应反复持续发生达到治疗作用有关，也可能与机体内环境及免疫调节有关。

本研究表明:激光照射抑制T.rubrum Y菌落生长的同时，也改变了菌体的超微结构。在扫描电镜下，菌丝的排列方式、菌丝表面的光滑度、菌丝的粗细及膨大等随着激光照射能量的增加而改变。透射电镜下激光照射破坏了菌丝壁的双层膜结构，细胞器结构等，可见空泡化、脂滴，可见髓样小体、蛋白凝固体等凋亡表现，以及菌体崩解坏死的影像，提示激光能量足够时，不仅仅是抑制真菌生长，也可发生不可逆转的杀灭真菌作用。Bornstein等7应用双波长(870 nm和930 nm)激光体外生理温度下作用于红色毛癣菌菌悬液，未照光组为对照组，孵育91 h后照光组红色毛癣菌100%被杀死。以上研究均为激光治疗甲真菌病提供了有力的客观证据。

本研究中，对菌落面积的检测，我们采用Photoshop软件分析菌落所占的像点数和坐标纸小方格的像点数，二者之比乘以小方格的面积即为菌落生长的面积，未照光组作为对照组，这种菌落面积的计算较传统的测量菌落直径的计算方法，更加可靠，具有说服力。在研究设计上，我们以未行激光照射的菌落为阴性对照，但没有考虑到激光照射对培养基质量的影响，应在以后的研究中明确等量的红色毛癣菌的菌悬液接种在激光照射的培养基和未行激光照射的培养基中，二者的生长曲线是否一致，从而明确激光照射是否对培养基的质量产生了影响。

本研究中，不同能量激光照射后T.rubrum Y菌落的生长曲线趋势与电镜下菌体的超微结构变化相辅相成，提示了激光照射对红色毛癣菌的抑制或杀伤作用，但样本有限，有待扩大样本量进一步研究。

1余进，李若瑜.国内甲真菌病病原学的流行病学调查.中国真菌学杂志，2006，1(1):63－64.

2Dai T，Tegos GP，Rolz－Cruz G，etal.Ultraviolet C inactivation of dermatophytes:implications for treatment of onychomycosis. Br JDermatol，2008，158(6):1239－1246.

3 Sotiriou E，Koussidou T，Patsatsi A，et al.5－Aminolevulinic acid－photodynamic treatment for dermatophytic tinea pedis of interdigital type:a small clinical study.JEur Acad Dermatol Venereol，2009，23(2):203－204.

4 Hochman LG.Laser treatment of onychomycosis using a novel 0.65－millisecond pulsed Nd:YAG 1064－nm laser.JCosmet Laser Therapy，2011，13(1):2－5.

5ChoilMJ，Zheng Z，Goo B，etal.Antifungal effects of a1444－nm neodymium:Yttrium－aluminum－garnet laser on onychomycosis:a pilot study.JDermatolog Treat，2014，25(4):294－297.

6 Zhang RN，Wang DK，Zhuo FL，et al.Long－pulse Nd:YAG 1064－nm Laser Treatment for Onychomycosis.Chin Med J(Engl)，2012，125(18):3288－3291.

7 Bornstein E.A review of current research in light－based technologies for treatment of podiatric infections diseases states.J Am Podiatr Med Assoc，2009，99(4):348－352.

8Vural E，Winfield HL，Shingleton AW，et al.The effects of laser irradiation on Trichophyton rubrum growth.Lasers Med Sci，2008，23(4):349－353.

(收稿:2014－06－06 修回:2014－06－09)

Effect of long pulse Nd:YAG 1064 nm laser irradiation on the grow th and ultrastructural changes of trichophyton rubrum

ZHUO Feng-lin，ZHANG Rui-na，WANG li，et al.Department of Dermatology，Beijing Friendship Hospital，Capital Medical University，Beijing 100050

Objective:To determine the effect of long pulse Nd:YAG 1064 nm laser irradiation on the growth and ultrastructural changes of richophyton rubrum Y(T.rubrum Y).Methods:Colonies of T.rubrum Y(same amount in each plate)was irradiated with long pulse Nd:YAG 1064 nm laser in different energy (0 J/cm2，200 J/cm2，400 J/cm2，600 J/cm2).The changes of colonies and growth curve after laser irradiation in day 1 to day 9 were observed.Themorphology of T.rubrum Y was observed under scanning electronmicroscope(SEM)and transmission electronmicroscope(TEM)images.Results:Growth of T.rubrum Y colonieswas inhibited following 400 J/cm2laser irradiation.The growth of T.rubrum Y colonieswas stopped after 600 J/cm2laser irradiation.Under SEM，T.rubrum Y hyphae become rough，fragmented，punctured with small destructive holes，shrunked and deflated.TEM images showed that the two layers of the cellwall disappeared or nonholonmic.The cytoplasmic membrane was discontinuous and myeloid body and small electron granuleswere found between retracted membrane and the cellwalls.In the cytoplasm，the cell organelleswere unclear.Hyphae of T.rubrum Y was disintegrated and necrosis following 600 J/cm2laser irradiation.Conclusion:These findings suggest that enough laser energy can inhibit or terminate the growth of T.rubrum colonies and change the ultrastructure of T.rubrum Y.

Long pulse Nd:YAG 1064 nm laser；Trichophyton rubrum Y

国家自然科学基金(编号:81301385)

首都卫生发展科研专项资助项目(编号:2011－1003－03)

首都医科大学附属北京友谊医院皮肤科，北京，100050

∗通信作者