产漆酶菌株的筛选及产酶条件的优化

王巍杰，张 杰

(1.河北联合大学生命科学学院，河北唐山063009;2.河北联合大学化学工程学院，河北唐山063000)

漆酶(Laccase，E.C.1.10.3.2)是一种含铜多功能多酚氧化酶，属于蓝色氧化酶家族［1］，漆酶能够催化O－和P－联苯酚、多酚、芳香胺、苯硫醇和酚类染料等的氧化反应，在纸浆生物漂白、废水处理、苯氧基类除草剂去毒等领域得到了广泛的研究和应用［2］。产漆酶菌株在自然界中分布广泛，但自然条件下能够有效分解木质素且产酶率较高的菌株不多，远远无法满足工业生产对漆酶的需要。漆酶最早从漆树中发现，一些高等真菌和细菌也能分泌漆酶，目前研究和应用最广泛的是担子菌、子囊菌等微生物，尤其是担子菌中的白腐真菌［3］。本文研究从腐木中筛选产漆酶较高的菌株，探索葵花粉发酵产漆酶的优化条件。

1 材料与方法

1.1 材料

样品:来源于河北省唐山市南湖公园潮湿土壤的腐朽木材。

葵花粉:向日葵花盘采摘自河北唐山周边地区，冲洗、晒干、粉碎、过筛。

1.2 培养基

1.2.1 愈创木酚PDA固体培养基:土豆浸液1000 mL，葡萄糖20 g，KH2PO43.0 g，MgSO41.5 g，酵母浸膏0.5 g，琼脂18 g，愈创木酚0.4 mL，pH自然，于121℃灭菌20 min。

1.2.2 液体种子培养基:葡萄糖10 g，酵母浸膏0.5 g，CuSO4·5H2O 4 mg，营养盐浓缩液100 mL，微量元素浓缩液1 mL，pH5.8醋酸缓冲溶液50 mL，定容至1000 mL，于121℃灭菌20 min;

营养盐浓缩液:MgSO4·7H2O 0.2g，KH2PO420g，(NH4)2SO414g，CaCl2·2H2O 4g，H2O 1000 mL。

微量元素浓缩液:FeSO4·7H2O 5g，MnSO4·7H2O 1.6g，CoCl2·6H2O 3.7g，ZnSO4·7H2O 1.4g，H2O 1000 mL。

1.2.3 产酶培养基:葵花粉50.00 g，KH2PO43.0 g，MgSO41.5 g，CaCl40.1 g，酵母浸膏0.5 g，微量元素浓缩液1 mL，pH5.8醋酸缓冲溶液100 mL，定容至1000 mL，分装后于121℃灭菌20 min。

1.3 方法

1.3.1 初筛

将腐朽木材粉碎成直径2 mm的小块，用无菌蒸馏水反复漂洗2～3次，每次约1 min，然后用少量医用乙醇进行短时间漂洗消毒，最后用无菌蒸馏水洗掉乙醇。用无菌滤纸将样品吸干后，点接到愈创木酚PDA固体培养基平板上，每个平板2－3块，28℃培养，观察菌落颜色及其周围有无棕红色菌圈产生，挑选出长菌落生长活力较高、变色圈直径较大颜色较深的菌株，反复纯化直至初步获得纯菌株，4℃冰箱保藏。

1.3.2 复筛

将保藏的菌种菌丝接种到不含愈创木酚的PDA平板上，28℃培养活化，待平板刚好长满菌丝，将菌丝接种到含有玻璃珠的50 mL基础产酶培养基，28℃，150 r/min，振荡培养5 d，测漆酶活性。

1.3.3 种子液制备及发酵培养

挑取菌丝接种到含有玻璃珠的50mL种子培养基中，28℃，150 r/min，振荡培养48 h，备用。

称取2.50 g葵花粉于250 mL三角瓶中，按1:20加入基础产酶培养基50 mL，121℃灭菌20 min。待冷却至常温，接入适量种子液，28℃，150 r/min振荡培养7 d。发酵液于4℃、4000 r/min离心的上清液，即为粗酶液。

1.3.4 漆酶活力测定

准确量取0.1 mL粗酶液于2.5 mL pH4.5的醋酸缓冲液后，加入0.4 mL 1 mmol/L的ABTS溶液，静置30 s，紫外－可分光光度计在420 nm下测定吸光度，计算漆酶活力［4，5］。

2 结果与分析

2.1 菌种筛选

经平板筛选纯化、美兰染色、显微镜观察菌丝形态和漆酶活性测定得到一株产漆酶白腐菌菌株［6］。

2.2 产漆酶条件的初步优化

2.2.1 培养时间对产漆酶的影响

将适量种子液接种到适宜基础发酵培养基，150 r/min、28℃振荡培养，从2 d开始测定漆酶活力，实验结果见图1。结果显示:随着时间的延长，酶活力逐渐增加，7d酶活达到34.35U/mL，随后酶活变化不大，10 d后随着时间增加酶活力逐渐降低，因此，确定产漆酶时间为7 d。

2.2.2 不同氮源对产漆酶的影响

分别按0.025%的添加量向适量产漆酶培养基加入硝酸铵、尿素、氯化铵、硫酸铵和蛋白胨四种氮源，控制相同适宜接种量，150 r/min、28℃振荡培养7 d，测定漆酶活力，实验结果见图2。表明不同氮源产漆酶活力的影响顺序为硫酸铵＞硝酸铵＞氯化铵＞尿素＞蛋白胨，因此，确定硫酸铵为最佳氮源。

2.2.3 pH值对产酶的影响

控制相同接种量和培养基，将发酵液 pH值分别用0.1 mol/L的乙酸、乙酸钠溶液调节至4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5和7.0，150 r/min、28℃振荡培养7 d，测定漆酶活力，实验结果见图3。结果表明随着培养基pH值从4.0至5.5，漆酶活力逐渐升高，pH值5.5产漆酶活力最大49.79 U/mL;pH值在6.0～7.0之间，漆酶活力逐渐降低。因此，确定pH值为5.5。

2.3.4 接种量对产漆酶的影响

分别接种6%、8%、10%、12%、14%不同体积比的种子液于相同发酵液中，控制相同的发酵条件:pH值5.5，28℃振荡150 r/min培养7 d，测定漆酶活力，实验结果见图4，结果显示，在接种量2%～12%的范围内，随着接种量的逐渐增加，酶活力逐渐增加，8% 时达到最大值，随后酶活力呈下降趋势。因此，确定接种量为8%。

图1 培养时间对产酶的影响

图2 不同氮源对产漆酶的影响

图3 pH对产漆酶的影响

2.3.5 装液量对产漆酶条件的影响

将30、40、50、60、70、80、90 mL发酵培养基分别装入250 mL三角瓶，接种8%的种子液，调节pH值为5.5，150 r/ min、28℃振荡培养7 d，测定漆酶活力，实验结果见图5。结果显示在装液量30～80 mL范围内，随着装液量的逐渐增加，酶活力逐渐增加，50 mL时酶活力达到最大值50.55 U/mL，随后逐渐减小。因此，确定装液量为50 mL

2.3.6 诱导剂及表面活性剂对产酶的影响

在250 mL的50 mL发酵培养基中分别添加0.01%的愈创木酚、ABTS、苯酚、吐温－80、吐温－20和SDS，控制接种量8%、pH值5.5、150 r/min、28℃振荡培养7 d，测定漆酶活力，实验结果见图6。结果表明:与不加任何诱导剂及表面活性剂的空白相比，加入愈创木酚和苯酚，漆酶活力均得到了较大程度的提高，而ABTS对漆酶活力影响不大;吐温－80对漆酶分泌有较高的促进作用，而其他表面活性剂特别是吐温－20对漆酶的分泌都有明显的抑制作用，可能是因为这些表面活性剂对菌体细胞造成了一定程度的损害，影响了漆酶的分泌。因此，可在发酵培养基中添加0.01%的愈创木酚。

图4 接种量对产漆酶的影响

图5 装液量对产漆酶的影响

图6 诱导剂及表面活性剂对产漆酶的影响

3 结论

从潮湿腐木筛选产漆酶白腐菌菌株菌种，以漆酶活性为指标，确定以葵花粉为原料产漆酶的条件:发酵培养基中0.025%硫酸铵，pH5.5，接种量8%，装液量50 mL，愈创木酚0.10%，培养时间7d。

［1］ Nina H，Laura-Leena K，etal.Crystal structureofa laccase from Melanocarpusalbomyceswith an intact trinuclear coper site［J］.Nat Struct Biol，2002，9(08):601-605.

［2］ Riva S.Laccases:blue enzymes for green chemistry［J］.Trends in Biotechnology，2006，24(5):219-226.

［3］ 董亮，谢冰，黄民生，等.白腐真菌酶学与分子生物学研究进展［J］.环境科学与技术，2005，28(5):102-104.

［4］ 刘春凤.漆酶高产菌株选育及其降解秸秆木质素机理研究［D］.合肥:安徽农业大学，2009.

［5］ 赵文娟，徐升远，任平.变色栓菌产漆酶培养条件优化及酶学特性研究［J］.食品工业，2013，34(3):162-166.

［6］ 关艳丽，李莉，陈飞，等.1株产漆酶白腐真菌的筛选和鉴定［J］.微生物学杂志，2010，30(3):74-77.