石英晶体微天平应用于蛋白质吸附检测的研究

陈卓玥 蔡玉龙 张成 蔡虎 陕西省医疗器械检测中心 （西安 710075）

石英晶体微天平技术的发展始于上世纪60年代初期，1959 年Sauerbrey 发表论文[1]指出石英谐振器频率的移动与增加的质量成正比例，此发现被看作是一个突破，迈出了利用一种新的定量方法来测量微量物质的第一步，进而提出了石英微天平。QCM-D 现已成为实验室常见的质量感测设备，其灵敏度为0.001mg，比灵敏度是0.1mg 的电子微天平高100 倍，理论上可以测到质量变化相当于单分子层或单个原子层的几分之一。QCM-D 所具有的高灵敏度以及在石英晶体上可实时测量质量变化的特点，使它在很多领域的应用上成为一种极具吸引力的技术。1997 年Michael Rodahl 等人[2]应用QCM-D 检测生物分子的吸附量和细胞的粘附情况。2005 年Hianik 等人[3]将QCM 技术应用于DNA 适配子和凝血酶复合物的检测研究，获得了精确的数据。近年来有大量的研究报道，QCM 技术应用于人血清白蛋白吸附研究[4]，材料表面结合CD34 抗体的研究[5]，以及定量乳清蛋白吸附的研究[6]均取得了突破性研究进展。采用QCM 技术可获得高精度的数据，使其成为定量检测蛋白质在材料表面吸附研究的热点。

1. QCM 主要结构和作用

图1. 石英晶片盒以及用专用镊子夹起的石英晶片

图2. (A)整套QCM 检测设备；(B)四个检测模块

图3. QCM 实验装置示意图

QCM 的主要组成有三个部分：石英晶体传感器、信号检测和数据处理器。石英晶体振荡片是从一块石英晶体上沿着与石英晶体主光轴成+35˚15ʹ切割(AT—cut)得到，在它的两个对应面上涂敷金膜作为金电极，结构见图1。在每个电极上各焊一根引线接到管脚上，再加上封装外壳就构成了石英晶体谐振器，其产品一般用金属外壳封装，也有用玻璃壳、陶瓷或塑料封装的。石英晶体微天平的其他组成结构在不同型号和规格的仪器中也不尽相同，可根据测量需要选用或联用。一般附属结构还包括振荡线路、频率计数器、计算机系统等；电化学石英晶体微天平在此基础上还包括恒电位仪、电化学池、辅助电极、参比电极等；另外经常加装一些辅助输出设备，例如显示器、打印机等。QCM 试验装置实体图及示意图分别见图2 和图3。

2. QCM 检测原理

QCM 作为一种感应表面质量变化的传感器，在蛋白质吸附的研究方面，已经发挥了重要的作用。压电石英晶体生物传感器主要由用生物识别物质包被的压电石英晶体、振荡器和频率计数器等组成[7]。

压电石英晶体谐振测量技术是应用压电效应进行测量的。石英晶体在交变激励电压施加于两侧的电极时，会产生机械振荡。当交变激励电压的频率与石英晶体的固有频率相同时，振幅变得比一般情况下大得多，形成压电谐振。一定质量的物质沉积在石英晶体表面，其振荡频率就会发生相应变化。石英晶体谐振频率和晶体电极表面质量负载变化之间的关系可由Sauerbrey 方程[1]表示：

ΔF = -KF2ΔM/A

公式中 ΔF—晶体吸附外来物质后振动频率的

变化，单位Hz；

K—常数；A—为被吸附物所覆盖的

面积，单位m2；

F—压电晶体的基本频率，单位MHz；

ΔM—被吸附物质的质量，单位g 。

由方程可知，ΔF 与ΔM 呈线性关系。此公式仅适用于气相反应环境，在液相环境中粘度、密度、电导率和溶液极性等影响ΔF 与ΔM 的量值关系。1985 年，Bruckenstein 与Kanazawa 等人先后建立了Voigt 黏弹性模型：

Δf = f3/2 (ρη/πρqηq ) 1/2

ρ：溶液的密度；η：溶液的粘度；ρq：纯水的密度；ηq：纯水的粘度

除盐溶液和高聚合物溶液外，在其他溶液中晶片的频率变化Δf 与溶液的(ρη) 1/2 是呈线性变化的[8]，使QCM 得以应用于液相反应环境中。

化学池里的外来物质均匀地附着于电极表面上，引起电极震动频率的变化，附着物质的质量变化引起震动频率相关的变化，从而可以测量到纳克级别的质量变化[9]。同时电极表面的能量变化可以表示出附着电极表面的物质的粘度变化。

3. QCM 检测方法

3.1 清洗石英晶片

从晶片盒中用专用镊子取出石英晶片，放入专门用来清洗石英晶片的托子上。用吸管吸取配好的溶液（溶液体积配比为氨水:双氧水:双蒸水= 5:1:1）到小烧杯中，吸取溶液的体积到可以浸没过托子上晶片的程度，将装了清洗液的小烧杯口用锡箔纸封住，放入75˚C 水浴箱中加热到75˚C±2˚C。取出小烧杯，将放了晶片的托子放入小烧杯，再放入75˚C±2˚C 水浴箱中保持15 分钟。取出托子，用双蒸水清洗晶片，清洗后自然风干，将石英晶片放入晶片盒中。

3.2 电极预处理

首先配制预处理溶液，用锡箔纸罩住培养皿口，放到恒温磁力搅拌器上，温度调节为80˚C±2˚C。待溶液温度控制到80˚C±2˚C 后，用专业镊子夹取金片放入配好溶液的培养皿中，约10 分钟，取出金片，将金片放入盛有双蒸水的培养皿中清洗。

3.3 测定蛋白质吸附情况

将预制浓度的蛋白质溶液以固定流速（通常为50μl/min）通入检测模块，设定通过模块的溶液温度（常用温度为37˚C），直到QCM 曲线稳定，辅助输出设备会随时间变化跟踪记录石英晶片震动频率以及能量的变化，对应为石英晶片表面吸附蛋白质质量和粘度变化。

3.4 清洗检测模块及石英晶片

3.4.1 清洗检测模块步骤如下：

（1）用PBS 冲洗，流速适当调大，冲洗3 到5 分钟；

（2）用SDS 冲洗；

（3）用双蒸水冲洗；

（4）抽空；

（5）打开模块，两面用吹风机吹干。3.4.2 清洗石英晶片步骤如下：

（1）将氨水水浴加热到75˚C±2˚C，晶片放在托子上，放入氨水中浸泡15 分钟；

（2）SDS 水浴加热到70˚C±2˚C，将放有晶片的托子放入，维持15 分钟；

（3）双蒸水加热到70˚C±2˚C，将晶片放入，浸泡15 分钟；

（4）取出晶片，自然风干后，放入石英晶片盒中。

4. QCM 技术在蛋白质吸附领域的应用

Shons 等人于1972 年首次报道将BSA 固定 于压电晶体表面用于检测BSA 抗体。目前QCM 技术已应用于免疫球蛋白、白蛋白、纤维蛋白(原)及降解产物、补体、酶蛋白、甲状腺素、人绒毛膜促性腺激素及皮质醇等检测[9]。测定抗原/抗体等生物样品所使用的免疫传感器可分为无标记（直接测定）型和标记（间接测定）型两种类型[10]。王珂等人[8]提出，无标记型免疫传感器通过直接测定抗原抗体复合物形成时的物理、化学变化，极大地简化制备和操作过程。石英晶体微天平作为无标记型免疫传感器中的一种，近年来成为应用于抗原/抗体检测研发的热点。QCM 技术应用于蛋白质吸附研究具有以下优点：

（1）生物样品无需标记；

（2）能够实时记录蛋白质在材料表面的吸附行为；

（3）传感器表面可清洗重复利用；

（4）可在短时间内完成蛋白质吸附检测，具有高效性。

近年来，由于临床诊断、环境保护、食品和医药等领域发展的实际需求，在分析过程中越来越多地需要对被分析物进行快速、在线、痕量的分析和监测，相信随着QCM 技术的快速发展和应用的日趋成熟，其将会更广泛地应用于微量检测研究领域。

[1] Sauerbrey G Z. Use of quartz vibration for weighing thin films on a microbalance[J]. J. Physik, 1959, 155: 206-212.

[2] Rodahl M, Höök F, Fredriksson C, et al. Simultaneous frequency and dissipation factor QCM measurements of biomolecular adsorption and cell adhesion[J]. Faraday Discussions, 1997, 107: 229-246.

[3] Hianik T, Ostatná V, Zajacová Z, et al. Detection of aptamer–protein interactions using QCM and electrochemical indicator methods[J]. Bioorganic & medicinal chemistry letters, 2005, 15(2): 291-295.

[4] Indest T, Laine J, Kleinschek K S, et al. Adsorption of human serum albumin (HSA) on modified PET films monitored by QCM-D, XPS and AFM[J]. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects, 2010, 360(1): 210-219.

[5] Lin Q, Ding X, Qiu F, et al. In situ endothelialization of intravascular stents coated with an anti-CD34 antibody functionalized heparin–collagen multilayer[J]. Biomaterials, 2010, 31(14): 4017-4025.

[6] Liu SX, Kim JT. Application of Kevin–Voigt Model in Quantifying Whey Protein Adsorption on Polyethersulfone Using QCM-D. Journal of the Association for Laboratory Automation. 2009. 14(4): 213-220.

[7] 陈秀美. 注流式液相压电物物感测晶片开发与应用. Chemistry (The Chinese Chem. Soc., Taipe1). 2001, 59(6):253-256.

[8] 王珂, 江德臣, 刘宝红, 张松, 吕太平, 孔继烈. 无标记型免疫传感器的原理及其应用. 分析化学. 2005, 33.

[9] 王惠民. 石英晶体微天平技术及在医学中的应用. 南通大学学报: 医学版. 2006, 25(5):393-394.

[10] Skladal P. Electroanal. , 1997, 9 (10) : 737～745