生物人工血管的生物相容性研究

陈丹丹 彭新洁 李彦红 王召旭 中国食品药品检定研究院 （北京 100050）

生物人工血管是以猪的血管为原料，经过特殊生物处理技术制成，主要用于外科上血管病变的替代和旁路搭桥手术。生物人工血管的结构是内部光滑，不易凝血，且容许内皮细胞爬行覆盖；外表面呈纤维状，可供组织粘附爬行，植入部位不易受到感染。

理想的生物材料应具有良好的生物相容性，应对细胞、组织等无毒性、无刺激性、无致畸致突变性。本研究按照GB/T16886 医疗器械生物学评价的要求对生物人工血管进行了细胞毒性试验，急性毒性试验，皮内刺激和致敏试验，溶血试验，亚慢性毒性试验，植入试验，遗传毒性试验，从体内体外两方面评价生物人工血管的生物相容性[1～6]。

1.材料和方法

1.1 材料

生物人工血管，生产单位：广州宏畅生物科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 细胞毒性试验

取样品2.0g 加细胞培养液10mL，在37˚C 浸提24 小时，取浸提液作为供试液。制备L929 细胞（小鼠成纤维细胞）悬液：消化吹打计数，将细胞浓度调整为1×105·mL-1，吸100μL 细胞悬液注入培养板内，放入含5%的CO2恒温培养箱中培养24 小时。阳性对照：含20%DMSO的MEM 培养液。阴性对照：高密度聚乙烯。弃去原培养液，每孔分别加入100μL 的空白对照液、阴性对照液、阳性对照液、试验样品浸提液，每组设6 孔。24 小时后弃去孔内液体，每孔加入20μL MTT，在CO2恒温培养箱中培养4～6 小时后弃去孔内液体，每孔分别加入150μL DMSO，10 分钟后振荡，用双波长（570nm 和630nm）法测定吸光度[7]。

1.2.2 急性毒性试验

取样品2.0g 加氯化钠注射液10mL，在37˚C浸提72 小时，取浸提液作为供试液。体重为18-21g 的昆明种小鼠（共10 只，雄性）随机分为对照组（空白对照液）和实验组（供试液组）。将浸提液以50ml·kg-1的比例经尾静脉注射入实验组体内，将生理盐水以50ml·kg-1的比例经尾静脉注射入对照组体内。注射后观察小白鼠即时反应并于4、24、48 和72 小时观察和记录实验组和对照组动物的一般状态、毒性表现和死亡动物数[8]。

1.2.3 皮内刺激试验

取样品2.0g 加氯化钠注射液10ml，在37˚C恒温摇床浸提72 小时，取浸提液作为供试液。将体重为2.0kg～2.2kg 的3 只家兔于试验前（24 小时）背部去毛备用，在脊柱右侧选5 个点注射试验样品，每点间隔2cm，同法在左侧选5 个点注射氯化钠注射液（阴性对照），各点注射量为0.2ml。分别在24 小时、48 小时和72 小时内观察接触部位的反应情况，按照GB/T16886.10-2005 中的方法判定其结果并记分。

1.2.4 皮肤致敏试验

取样品4.0g 加氯化钠注射液20ml，在37˚C恒温摇床浸提72 小时，取浸提液作为供试液。按照GB/T16886.10-2005 中的方法进行皮内诱导、局部诱导及激发试验，判定其结果。

1.2.5 溶血试验

取样品1cm×5cm 大小，加入生理盐水8ml，制备3 份。阴性对照组：生理盐水10ml，3 管。阳性对照组：蒸馏水10ml，3 管。将各组分别置于37˚C 水浴60 分钟。将水浴后的各样品管分别加入0.16ml 抗凝兔血，对照管加入0.2 ml 抗凝兔血，再次在37˚C 水浴60 分钟。将水浴后的各管以800g 离心5 分钟后，吸取上清液。在545nm波长处读取各管上清液的吸光度值。

1.2.6 亚慢性毒性试验

体重为230～250 克的SD 品系雄性大鼠30只按体重随机分为3 组，每组10 只，分别对高剂量组大鼠尾静脉注射浸提比例为0.4g·ml-1注射剂量为10ml·kg-1的生理盐水浸提液， 对低剂量组大鼠尾静脉注射浸提比例为0.2g·ml-1注射剂量为10ml·kg-1的生理盐水浸提液，对照组给予10ml·kg-1生理盐水。

给供试品期间密切观察各组动物的外观体征、粪便性状，每日称体重一次。

连续给药14 天后（解剖前夜禁食），10%水合氯醛，0.3ml·100g-1对大鼠腹腔注射麻醉后，下腔静脉取血，分别测定血液指标：血红蛋白浓度（HGB）、红细胞数（RBC）、红细胞压积（HCT）、血小板数（PLT）、白细胞数（WBC）、白细胞分类计数（DC）、凝血酶原时间（PT）、平均红细胞体积（MCV）、平均红细胞血红蛋白含量（MCH）和平均红细胞血红蛋白浓度（MCHC）等血液学指标；血液经离心分离血清，测定天门冬氨酸氨基转换酶（AST）、丙氨酸氨基转换酶（ALT）、碱性磷酸酶（ALP）、尿素（UREA）、总蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、血糖（GLU）、总胆红素（T-BIL）、肌酐（CRE）、总胆固醇（T-CHO）、钙、氯、磷等血清生化学指标。

并于次日处死，系统尸解，称取心、肝、脾、肾、肾上腺、脑、胸腺、睾丸、附睾的重量并计算脏器系数。肉眼观察后，将上述组织全部放入中性10%甲醛溶液中固定，石蜡切片、HE 染色、显微镜下观察各脏器的病理组织学变化[9]。

1.2.7 植入试验

以B 型硬脑(脊)膜补片为对照，将样品和对照剪成10mm×10mm，选用12 只家兔。体重 2000～2500g。腹腔注射30mg·kg-1戊巴比妥钠麻醉后， 背部术野剃毛，碘酒，酒精常规消毒。左，右侧脊柱两侧皮下各植入3 个植入物。左侧为对照， 右侧为样品。于植入后1 周，4 周，12 周取材进行病理制片，显微镜观察。

1.2.8 鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验

取样品1.8g，加氯化钠注射液9ml，在37˚C 恒温摇床浸提72 小时，制备浸提液。试验采用鼠伤寒沙门氏菌组氨酸缺陷型突变株(TA97，TA98，TA100 和TA102)。阴性对照为同批号浸提介质生理盐水(NS);阳性对照为敌克松（500μg·ml-1），2-氨基芴（2mg·ml-1），1,8-二羟基蒽醌（500μg·ml-1）。代谢活化系统：选用健康雄性成年Wistar 大白鼠，采用合并诱导方法制备S9。试验采用平板掺入法，试验设阴性对照、阳性对照、浸提液组、1/2 浸提液组、1/4 浸提液组。非活化试验：加入0.2mol·L-1磷酸缓冲液0.5mL 及受试液、新鲜菌液各0.1mL。活化试验：加入5%S9mix0.5mL 及受试液、新鲜菌液各0.1mL，置37˚C 培养72h 后统计回变菌落数，同时做S9mix检菌。

1.2.9 体外哺乳动物细胞染色体畸变试验

取样品4.7g 加入含血清的1640 培养液23.5mL，在37˚C 恒温摇床浸提24 小时，制备浸提液。试验设阴性对照、阳性对照、浸提液组、1/2 浸提液组、1/4 浸提液组。细胞株采用中华仓鼠肺成纤维细胞(CHL);阴性对照为同批浸提介质，阳性对照为0·25μg·ml-1丝裂霉素(-S9mix)和20μg/mL 环磷酰胺(+S9mix);代谢活化用多氯联苯诱导哺乳动物肝微粒体酶(S9)进行代谢活化。试验方法采用正常培养的CHL 细胞经消化液作用后，制成5×104个·mL-1细胞悬液，每个细胞培养皿接种3.0mL，培养24h 后吸去培养液，加入测试样品浸提液。活化组S9mix作用6h 后换液，培养24h 收获细胞，非活化组分别于作用24h 和48h 后收获细胞，制备染色体，Giemsa 染色，显微镜下观察100 个中期分裂相。

1.2.10 哺乳动物细胞体外基因突变试验

取样品3.5g 加入含血清的1640 培养液17.5mL，在37˚C 恒温摇床浸提24 小时，制备浸提液。试验设阴性对照、阳性对照、浸提液组、1/2 浸提液组、1/4 浸提液组。阴性对照为无血清培养液；阳性对照非活化系统为1.0mg·ml-1甲基磺酸乙酯溶液（EMS）， 活化系统为250μg·ml-17,12-二甲基苯蒽（DMBA）。

取纯化V79 细胞，每个50mL 大小的培养瓶接种5.0×105个细胞，培养20 小时后，非活化系统分别加入5.0mL 材料浸提液及对照液；活化系统分别加入4.5mL 材料浸提液及对照液后，再加入0.5mL S9 混合液，置于CO2培养箱中培养4h。弃去含受试物的培养液，D-Hankʼs 洗涤后，换完全培养液培养20h。上述细胞经消化液消化、计数，将细胞接种于6 孔板中，每孔接种2.0×102个细胞，培养7 天后用甲醇固定，姬姆萨染色，计数形成的集落。另外在50ml 的培养瓶中接种5.0×105个细胞进行表达。中间低密度传代一次。表达结束后，消化计数，6 孔板的每孔中接种2.0×102个细胞，7 天后测定细胞克隆形成率。同时在6 孔板的孔中接种1.5×105个细胞，2 小时后加入含6-TG 选择培养液培养，作HGPRT 基因突变集落选择，选择期为10 天，计算基因位点突变频率。

2.结果

2.1 细胞毒性试验：样品试验液的细胞毒性分级按GB/T16886·5 中规定的分级原则为0 级，阴性对照为1 级，阳性对照为4 级。生物人工血管细胞毒性反应为0 级，符合临床使用要求。

2.2 急性毒性试验：按国家标准GB/T16886·11中规定的标准方法进行，结果小鼠活动正常，未见任何异物反应。在观察期间动物体重增加和阴性对照相比无任何差异，说明生物人工血管无全身急性毒性反应。

2.3 皮内刺激试验：家兔脊柱两侧在注射后24h、48h 和72h 观察注射点，试验组和阴性对照均为0级，说明生物人工血管无皮内刺激作用。

2.4 致敏试验：按GB/T16886·11 中规定的最大剂量法进行试验，结果阴性对照组和材料试验组相比无明显差异，均未观察到致敏作用。

2.5 溶血试验：计算溶血率=（OD 样品–OD 阴性对照）/（OD 阳性对照–OD 阴性对照）=（0.025–0.014）/（0.881–0.014）= 1.2%，符合溶血率不大于5%的标准规定。

2.6 亚慢性毒性试验：生物人工血管生理盐水浸提液（0.4g·ml-1），SD 雄性大鼠尾静脉注射（10ml·kg-1），连续给予14 天，结果样品各剂量组体重增长正常，未发现临床征象等一般毒理学指标方面异常，大体和组织病理学检查，未见各脏器明显中毒性病理改变。血液学、生物化学相关指标显示，样品高剂量组HCT、RBC、HGB、PLT、GLU、UREA、C1 升高，WBC、CRE 降低；低剂量组RBC、HCT、HGB、PLT、GLU、UREA、C1，升高，ALT 降低。凝血酶原时间高低剂量组均高于阴性对照组，其余未见与阴性对照组有统计学差异。

2.7 植入实验：样品植入后肉眼观察所见：各时间点皮肤切口愈合良好，未见局部红肿及感染。显微镜下所见：对照1 周（图1）：疏松结缔组织中，可见一条带，由红染的纤维束样材料组成，呈纵行排列，之间有缝隙，四周可见菲薄的胶原纤维，成纤维细胞，和纤维细胞包绕而成的囊壁。偶见淋巴细胞，另偶见小血管和神经切面(炎I， 纤I-II) 。样品1 周（图2）：疏松的脂肪结缔组织中可见一红染束状植入物，呈纵向排列的细胞网状，部分致密，部分疏松，边缘处和四周可见淋巴细胞，吞噬细胞和坏死的细胞碎片，外周可见由成纤维细胞，纤维细胞和胶原纤维构成的囊壁，偶见粒细胞(炎II-III， 纤I-II)。对照4 周（图3）：疏松的脂肪结缔组织中，可见一条带植入物，由红染的纤维囊组成，纵行疏松排列，四周可见由成纤维细胞，纤维细胞和菲薄的胶原纤维构成的囊壁。四周偶见淋巴细胞散在分布，囊内材料与囊壁间偶见空隙(炎I， 纤I)。样品4 周（图4）：疏松脂肪结缔组织中可见一红染束状植入物，部分致密，部分疏松，四周可见由成纤维细胞，胶原纤维构成的囊壁，囊壁与周围疏松结缔组织中偶见少许淋巴细胞浸润(炎I， 纤I)。对照12 周（图5）：疏松结缔组织中，可见一条带状植入物，呈红染束状，纵行疏松排列，四周可见由胶原纤维和纤维细胞构成的菲薄的囊壁，偶见淋巴细胞在囊周分布(炎I， 纤I）。样品12 周（图6）：疏松脂肪结缔组织中可见一红染植入物，呈纵向束带状，部分致密，部分疏松，有些切片可见蓝色钙盐在材料局部沉积，有囊壁形成，由胶原纤维和纤维细胞及脂肪结缔组织形成，部分切片可见较多的淋巴细胞灶状浸润，四周仍可见小血管和神经切面。（炎症I，纤维I）。

图2. 样品植入后1 周

图3. 对照植入后4 周

图4. 样品植入后4 周

图5. 对照植入后12 周

图6. 样品植入后12 周

对照26 周（图7）：疏松的结缔组织中可见一条状植入物，为红染的纵行束状，排列疏松，四周可见菲薄的纤维胶原构成的囊壁，偶见条带两端处囊周有少许淋巴细胞浸润(炎症I，纤维I）。样品26 周（图8）：疏松脂肪结缔组织中，可见一束状红染植入物，呈纵向分布，部分颜色变浅，中间未见炎细胞，部分边缘区域变疏松，四周可见胶原纤维和纤维细胞包绕形成较厚囊壁，但较疏松，局部区域有淋巴细胞浸润，四周结缔组织中可见小血管和神经切面（炎症I，纤维I）。结论：样品植入后1 周，4 周，12 周，26 周样品的炎症反应和纤维囊形成与对照无明显差别。

2.8 遗传毒性试验：单纯采用一种试验方法不能有效评价材料的基因毒性，因此本研究选择了Ames试验、体外哺乳动物细胞染色体畸变试验、哺乳动物细胞体外基因突变试验综合评价。结果发现在活化和非活化条件下，生物人工血管的浸提液、1/2 浸提液、1/4 浸提液对试验所用4 种菌株的回变菌落数与阴性对照组比较，均未增加2 倍。表明在此实验条件下，样品的生理盐水浸提液对鼠伤寒沙门氏菌无诱变性。在活化和非活化条件下，生物人工血管的浸提液、1/2 浸提液、1/4 浸提液与中国仓鼠肺成纤维细胞（CHL）接触后，三个剂量浸提液染色体畸变率为0%，与空白对照组无显著差别，说明生物人工血管无诱导细胞染色体畸变作用。在哺乳动物细胞体外基因突变试验中，试验样品突变频率未达到或超过阴性对照突变频率的3 倍，未见试验样品突变频率的增高与剂量相关，未见某一剂量突变频率的增加有统计学意义。说明在活化和非活化条件下，生物人工血管的各剂量组浸提液对体外培养的V79 细胞无诱导HGPRT 基因突变作用。总之未观察到生物人工血管的遗传毒性作用。

图7. 对照植入后26 周

图8. 样品植入后26 周

3.结论

生物人工血管是一种新型的生物材料，通过按国家标准GB/T16886 医疗器械生物学评价系列标准（等同国际标准ISO10993）进行了全面的生物学评价，证明生物人工血管具有良好的生物相容性，是十分理想的血管替代物，在组织工程方面具有广阔的发展空间和应用前景。

[1] GB/T 16886.1 医疗器械生物学评价 第1 部分：风险管理过程中的评价与试验

[2] GB/T 16886.3 医疗器械生物学评价 第3 部分：遗传毒性、致癌性和生殖毒性试验

[3] GB/T 16886.5 医疗器械生物学评价 第5 部分：体外细胞毒性试验

[4] GB/T 16886.6 医疗器械生物学评价 第6 部分：植入后局部反应试验

[5] GB/T 16886.10 医疗器械生物学评价 第10 部分：刺激与迟发型超敏反应试验

[6] GB/T 16886.11 医疗器械生物学评价 第11 部分：全身毒性试验

[7] 郑琪 ,奚廷斐,陈艳梅等。细菌纤维素的生物相容性研究。药物分析杂志， 2010, 30 (7)： 1389-1392

[8] 王春仁，姜华，曹宏英等。止血防粘连生物纸的生物相容性研究。中国生物医学工程学 报，2007，26，（2）：293～295

[9] 王春仁, 王召旭, 宋谊萍等。止血纤维素材料亚慢性毒性实验研究。中国药事，2007 ，21 （9）：695-698