人TLR2基因启动子活性的研究

李苗，罗恩杰

（中国医科大学基础医学院病原生物学教研室，沈阳110001）

人TLR2基因启动子活性的研究

李苗，罗恩杰

（中国医科大学基础医学院病原生物学教研室，沈阳110001）

目的鉴定TLR2启动子结构，探索调控TLR2基因高水平转录的启动片段。方法利用生物信息学软件分析TLR2基因启动子结构，构建TLR2启动子序列系列截短的萤光素酶报告基因重组体，脂质体法转染分化成熟的U937细胞，应用双荧光素酶活性检测系统检测启动子的活性。结果-403～+20 bp和-190～+20 bp具有高转录活性，-140～+20 bp和-88～+20 bp启动子活性最低。结论人TLR2基因-190～-140 bp是主要的转录调控区，是进一步研究DNA结合蛋白的调控靶序列。

TLR2基因；转录；启动子

Toll样受体（Toll-like receptor，TLR）2是目前研究认为与免疫及炎性反应关系最为密切的TLR家族成员。TLR2具有相对广泛的配体特异性，可识别多种病原体相关分子模式，如革兰阳性菌肽聚糖、脂胞壁酸、脂蛋白，还包括某些病毒、螺旋体属、支原体属及分支杆菌属微生物等的病原体［1］。TLR2不但具有促进细胞因子的合成与释放、促进免疫细胞成熟、分化和功能化等作用，还在调节机体对入侵病原体的免疫应答水平方面有不容忽视的作用［2～4］。目前，对于TLR2的研究主要集中在其功能方面，而TLR2基因的启动子结构及上游调控因子尚不十分明确。本研究拟对TLR2基因上游5′侧翼区-403～+20 bp的片段进行启动调控活性分析，寻找调控人TLR2基因高启动活性片段，为阐明TLR2基因的转录调节机制奠定分子基础。

1 材料与方法

1.1 细胞培养及分化

用含10%胎牛血清的RPIM1640培养液培养U937细胞，将细胞置37℃、5%CO2培养箱中培养。取对数生长期的细胞，无抗生素培养液调整细胞浓度至106个；转种至4块6孔板，每孔加入PMA（美国Sigma Aldrich公司）100 ng/mL，37℃、5%CO2培养箱中培养孵育24 h。

1.2 TLR2基因启动子序列的克隆及载体构建

以人类基因组DNA为模板，分别扩增TLR2启动子区-403～+20 bp、-230～+20 bp和-190～+20 bp、-140～+20 bp、-88～+20 bp片段。引物序列如下：上游引物：5′-AGAAAATACTGGTTGGG-3′（-403 bp）、5′-TGTCGCAGCCTAGCTCAC-3′（-230 bp）、5′-GGAAGCACGGCCGCGGG-3′（-190 bp）、5′-GCGAG GTCCAGAGTTCCC-3′（-140 bp）、5′-TTCCCGCACC CCAGAAGG-3′（-88 bp）；下游引物：5′-GGAGGCAG CGAGAAAGCG-3′。按常规方法进行PCR，扩增产物经割胶小量柱纯化回收后，用pMD18-T载体经T4DNA连接酶（大连TaKaRa公司）连接，连接混和物转染至感受态大肠杆菌JM109并筛选，SacⅠ和HindⅢ双酶切后，T4DNA连接酶连接至pGL3 basic载体，鉴定正确后，经测序（北京华大基因公司），最后大量扩增阳性克隆，抽提、纯化质粒重组体，紫外分光光度计（Du2600，德国Beckman公司）测质粒纯度。

1.3 TLR2启动子活性检测

已分化细胞铺板至6孔板，脂质体法转染萤光素酶报告基因质粒0.8 μg，共转染海肾荧光素酶对照质粒0.01 μg作为内对照。Dual-GloTM双荧光素酶检测系统检测萤光素酶活性。

2 结果

2.1 TLR2基因5′侧翼序列结构分析

利用生物信息学软件ALiBaba2.1和TRANSFAC TESS，我们分析了TLR2基因5′侧翼序列-403～+20 bp区域结构，发现有多个潜在的顺式作用元件。见图1。

图1 TLR2启动区-403至+20 bp序列结构Fig.1 Region from-403 to+20 bp of the TLR2 promoter according to sequence

2.2 TLR2基因5′侧翼序列系列截短的萤光素酶报告基因重组体的鉴定

为了检测各段启动子的转录活性，根据距离转录起始点的位置，我们构建了系列截短的TLR2启动子萤光素酶报告基因载体p403-luc、p230-luc、p190-luc、p202-luc、p140-luc和p88-luc。经测序，插入片段与GenBank报道的序列（Accession NG_ 016229）完全一致。见图2。

2.3 TLR2基因启动子转录活性

通过荧光素酶报告基因检测系统我们检测了不同长度的启动子片段活性，结果发现p190-luc的活性显著高于其他片段；当p190截短至p140之后，p140-luc的活性明显下降，而且p140-luc和p88-luc的活性几乎达到pGL3-Basic（阴性对照）水平（图3）。因此，我们认为-190～-140 bp是TLR2基因的主要的转录调控区。

图2 TLR25′侧翼序列系列截短的萤光素酶报告基因重组体结构Fig.2 Schematic representation of a series of 5′⁃flanking deletions of the TLR2promoter luciferase reporter constructs

图3 TLR2启动子片段的基础转录活性Fig.3 Basal activity of TLR2 promoter luciferase reporter constructs in U937 cells

3 讨论

真核生物基因表达调控机制十分复杂，可以发生在DNA和染色质水平、转录和转录后水平、翻译和翻译后水平等，其中转录水平调控是基因表达调控最主要的方式［5］。启动子是基因转录最基本的调控区，一般位于基因转录起始点上游的数百个碱基以内，含有调节基因转录最基本的也是最重要的DNA顺式作用元件［6］。我们利用生物信息学软件分析发现TLR2基因缺乏典型的转录所需要的起始元件TATA box，但具有Spl、NF-κb、AP-2α和CEBPα等转录因子结合位点。这些元件都可能对TLR2表达起重要的调控作用。

根据反应元件的位置，我们采用双荧光素酶报告基因分析系统及构建系列截短荧光素酶报告基因载体的方法，克隆并分析鉴定了人类TLR2基因启动子区域403 bp内调控元件。荧光素酶的结果提示，TLR2基因-190～-140 bp区域对该基因的基础转录非常重要。经预测，该区域可能存在Spl、AP-2α、myoD等转录因子的结合位点。Spl是体内普遍表达的锌指蛋白转录因子，对转录调控区GC盒有很强的亲和力，Spl通过结合基因调控区的GC/GT盒以及与其他蛋白相互作用，发挥对基因转录的增强或抑制作用，几乎参与细胞的所有功能。转录因子Spl能帮助起动无TATA盒的启动子活化，TLR2基因的启动子区域就含有多个推测的Spl结合位点。有研究［7］证实，位于TLR2启动子-64 bp存在Spl反应元件，但其他的转录因子以及对TLR2基因转录调控的确切机制还不清楚，还有待于进一步研究。

综上所述，本研究成功构建了TLR2启动子区系列截短荧光素酶报告基因载体，预测了启动子区域含有的多个潜在的转录因子结合序列，为以后研究相关转录因子对TLR2基因的转录调控以及确认其核心启动子区奠定了分子基础。

［1］Vives PM，Somoza N，Fernandez Alvarez J，et al.Evidence of expression of endotoxin receptors CD14，Toll-like receptors TLR4 and TLR2 and associated molecule MD22 and of sensitivity to endotoxin（LPS）in islet beta cells［J］.J Clin Exp Immunol，2003，133（2）：208-218.

［2］Hertz CJ，Kiertscher SM，Godowski PJ，et al.Microbial lipopeptides stimulate dendritic cell maturation via Toll like receptor 2［J］.J Immunol，2001，166（4）：2444-2450.

［3］Druszczynska M，Wlodarczyk M，Janiszewska-Drobinska B，et al. Monocyte signal transduction receptors in active and latent tuberculosis［J］.Clin Dev Immunol，2013，2013：851452.

［4］Sasai M，Yamamoto M.Pathogen recognition receptors：ligands and signaling pathways by toll-like receptors［J］.Int Rev Immunol，2013，32（2）：116-133.

［5］李英慧，陈芳杰，李春义，等.神经细胞中乙酰化对NOS1基因启动子活性的调节［J］.中国医科大学学报，2011，40（3）：204-205.

［6］Juven-Gershon T，Kadonaga JT.Regulation of gene expression via the core promoter and the basal transcriptional machinery［J］.Dev Biol，2010，339（2）：225-229.

［7］Haehnel V，Schwarzfischer L，Fenton MJ，et al.Transcriptional regulation of the human toll-like receptor 2 gene in monocytes and macrophages［J］.J Immunol，2002，168（11）：5629-5637.

（编辑 陈姜）

Analysisof Promoter Activity for Human Toll-like Receptor2 Gene

LIMiao，LUOEn-jie
（DepartmentofMicrobiology，College ofBasic MedicalScience，China MedicalUniversity，Shenyang 110001，China）

ObjectiveTo identify the promoter structure of Toll-like receptor 2（TLR2）gene and explore the fragment with high promoter activity in TLR2gene.MethodsThe TLR2gene promoter was analyzed using bioinformatics software.A series of truncated luciferase reporter constructs were generated and assayed using Dual-Glo luciferase system.ResultsThe highest transcriptional activity was observed in the construction driven by the regions from-403 to+20 bp and-190 to+20 bp，the lowest transcriptional activity was observed in construction driven by the regions from-140 to+20 bp and-88 to+20 bp.ConclusionThe region of-190 to-140 bp within TLR2promoter is a key transcriptional regulatory region ofthe gene，which could be idealtargetsequencesforthe furtherstudy ofDNAbinding protein.

TLR2gene；transcription；promoter

R394.3

A

0258-4646（2014）06-0485-03

国家自然科学基金（81201333）

李苗（1981-），女，讲师，博士.

罗恩杰，E-mail：enjie359@yahoo.com.cn

2014-04-03

网络出版时间：