SPARC蛋白在乳腺癌组织中的表达及临床意义

徐东旭，徐璐，李彦君，李朝辉，李智，滕月娥

（中国医科大学附属第一医院肿瘤内科，沈阳110001）

SPARC蛋白在乳腺癌组织中的表达及临床意义

徐东旭，徐璐，李彦君，李朝辉，李智，滕月娥

（中国医科大学附属第一医院肿瘤内科，沈阳110001）

目的探讨富含半胱氨酸的分泌性酸性蛋白（SPARC）在乳腺癌组织的表达及其临床意义。方法收集1997年至2008年在我院行根治性手术的255例有完整随访资料的乳腺癌肿瘤组织石蜡标本，采用组织芯片制作和免疫组化方法检测SPARC蛋白在乳腺癌组织中的表达，分析其与临床病理因素及预后的关系。结果乳腺癌组织SPARC蛋白阳性表达率为76.1%，SPARC在乳腺癌组织中的表达与病理类型（P=0.007）及激素受体状态（P=0.034）相关。SPARC是否阳性表达对乳腺癌患者的无病生存时间（DFS）（P=0.451）、总生存时间（OS）（P=0.562）未显示出有统计学差别，亚组分析显示：绝经前SPARC阴性组患者的DFS优于SPARC阳性组患者的DFS，差别有统计学意义（P=0.013）。多因素Cox比例风险回归分析显示SPARC不是浸润性乳腺癌复发及死亡的独立预后因素。结论SPARC蛋白在乳腺癌的发生、发展中起一定作用，它与雌激素受体表达密切相关，可能是影响绝经前乳腺癌预后的重要指标。

乳腺癌；富含半胱氨酸的分泌性酸性蛋白；免疫组化；预后

乳腺癌在女性恶性肿瘤发病率中居首位，每年新发病例超过100万，死于恶性肿瘤的患者中有16%以上是死于乳腺癌［1］。乳腺癌已经成为妇女健康的最大威胁。但目前已知的关于乳腺癌的预后因素仍十分欠缺。富含半胱氨酸的分泌性酸性蛋白（secreted protein acidic and rich in cysteine， SPARC）是一种32 kDa分泌糖蛋白，也称为骨结合素（osteonectin，ON）及基膜40蛋白（basement membrane protein-40，BM40），与细胞外基质（extracellular matrix，ECM）蛋白相互作用，促进细胞黏附，诱导细胞迁移［2，3］。SPARC蛋白也被认为在组织重塑、血管生成、胚胎形成及肿瘤形成中起重要作用［4，5］。但目前关于SPARC蛋白在肿瘤细胞中的表达、与ECM相互作用的具体机制及对预后的影响仍不十分清楚。本研究应用组织芯片制作（tissuemicroarray，TMA）和免疫组化方法（immunohistochemistry，IHC）检测乳腺癌组织中SPARC蛋白的表达，并分析SPARC蛋白与临床病理特征之间的相互关系及其与患者预后的关系。

1 材料与方法

1.1 病例来源

1.1.1 入选标准：患者来源于我院接受改良根治术或保乳术的乳腺癌术后于肿瘤内科治疗的患者，病理诊断为浸润性癌，年龄≥18岁，TNM分期为Ⅰ～Ⅲ期，术前均未行任何放疗及化疗治疗，无严重、未控制的内科疾病及感染，无病生存时间（disease-free survival，DFS）≥6个月。

1.1.2 排除标准：既往或同时患有其他恶性肿瘤的患者，标本有限无法做进一步分析的患者。

本研究共纳入255例患者，均为女性，手术时间为1997年1月至2008年7月。患者年龄最小为26岁，最大76岁，平均年龄50岁。采用手术石蜡病理标本进行组织芯片制作，组织芯片制备委托上海芯超生物科技有限公司完成。

1.2 试剂

鼠抗人SPARC单克隆抗体（工作浓度为1∶500）购自英国Abcam公司；免疫组化SP试剂盒、生物素标记的羊抗鼠/兔IgG（二抗）、DAB试剂盒及柠檬酸修复液（100倍）均购自福州迈新生物技术开发有限公司；二甲苯、无水乙醇、0.01 mol/L磷酸盐缓冲液、蒸馏水、苏木素、中性树脂等均为国产试剂。

1.3 检测方法

采用SP免疫组化法。实验步骤严格按照说明书进行操作，用PBS代替一抗作阴性对照，用已知的胃组织SPARC阳性片作阳性对照。

1.4 结果判定标准

采用半定量积分法判定结果，SPARC阳性着色表现为胞质和间质呈棕黄色染色。先按染色强度计分：0分，无色；1分，浅黄色；2分，棕黄色；3分，棕褐色。在高倍镜下（×40）取5个不同视野，各计数100个细胞，再按阳性细胞所占百分比计分：0分，阴性；1分，阳性细胞≤10%；2分，11%～50%；3分，51%～75%；4分，＞75%。染色强度与阳性细胞百分比的计分乘积≥3分为免疫反应阳性，否则为阴性［6］。

1.5 统计学分析

用SPSS 21.0统计软件进行统计学分析。不同组间比较用χ2检验及Fisher确切概率法；生存率的比较采用Kaplan-Meier法，组间比较采用Log-rank检验，采用Cox比例风险回归分析进行预后因素分析。Cox比例风险回归模型分析中规定拒绝H0的水准α=0.1，其余分析设定P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SPARC蛋白在浸润性乳腺癌组织的表达及其与浸润性乳腺癌临床病理因素的关系

SPARC蛋白主要在乳腺癌组织的胞质和间质中表达，阳性表达率为76.1%，免疫组化染色见图1。

图1 乳腺癌中SPARC蛋白的表达SP×400Fig.1 Expression of SPARC protein in breast cancer SP×400

SPARC蛋白的表达在不同的雌激素受体（estrgen receptor，ER）表达患者中有统计学差异（P= 0.040）。SPARC的表达在不同年龄、月经状态、TNM分期、肿瘤大小、淋巴结转移、病理组织学分级、孕激素受体（progesterone receptor，PR）、HER-2状态中无统计学差异（P＞0.05）。见表1。

2.2 SPARC蛋白与浸润性乳腺癌患者复发和生存的关系

255例患者按照肿瘤分期及免疫组化情况，术后接受辅助化疗、内分泌治疗及放疗，术后每年1次随访生存数据。末次随访日期为2013年12月31日，终止日期为死亡日期或末次随访日期。随访期限从11～164个月不等，中位随访时间为92.00个月。复发患者72例，死亡患者47例，均为复发后死亡患者。Kaplan-Meier生存分析中，SPARC蛋白对乳腺癌患者的DFS（Log rank检验P=0.451）、总生存时间（overall survival，OS）无统计学差别（Log rank检验P=0.562）。见图2、图3。

亚组分析显示，诊断时绝经前的患者中，SPARC阴性患者的DFS优于SPARC阳性患者的DFS，差别有统计学意义（Log rank检验P=0.013）；但在OS分析中，SPARC阴性患者的OS优于SPARC阳性患者的OS，有统计学趋势，但差别无统计学意义（Log rank检验P=0.068）。见图4、图5。

表1 SPARC的表达与浸润性乳腺癌临床病理因素的关系Tab.1 Relationship between the expression of SPARC protein and clinical pathology of breast cancer

图2 SPARC阳性与阴性患者的DFS曲线Fig.2 DFS curves of patients with positive and negative SPARC expression

图3 SPARC阳性与阴性患者的OS曲线Fig.3 OS curves of patients with positive and negative SPARC expression

图4 诊断时未绝经患者的DFSFig.4 DFS curves of premenopausal patients when diagnosis

图5 诊断时未绝经患者的OSFig.5 OS curves of premenopausal patients when diagnosis

2.3 浸润性乳腺癌复发及死亡的Cox比例风险回归模型分析

2.3.1 浸润性乳腺癌复发的Cox比例风险回归模型分析：结果如表2所示，对患者复发有显著影响的因子为TNM分期（P=0.000）、淋巴结转移（P=0.001）、HER-2状态（P=0.050）、放射治疗（P=0.041），均为危险因子。而SPARC蛋白、诊断时年龄、诊断时月经状态、肿瘤大小、病理组织学分级、ER、PR、标准化疗、内分泌治疗对浸润性乳腺癌患者的复发均无明显影响。

表2 浸润性乳腺癌复发的单因素Cox比例风险回归模型分析Tab.2 Univariate Cox proportional hazard regression model analysis of invasive breast cancer for recurrence

将表2中初步筛选出的因子（协变量）统一引入多因素Cox比例风险回归模型分析，结果显示TNM分期是浸润性乳腺癌影响复发的独立危险预后因素（P=0.001，RR=2.838）。

2.3.2 浸润性乳腺癌死亡的Cox比例风险回归模型分析

单因素Cox比例风险回归模型分析结果显示对患者死亡有显著影响的因子为TNM分期（P＜0.001）、肿瘤大小（P=0.071）、淋巴结转移（P= 0.001）、PR（P=0.037）、内分泌治疗（P=0.012）。TNM分期、肿瘤大小、淋巴结转移是危险因子；PR状态及内分泌治疗是保护因子。而SPARC、诊断时年龄、诊断时月经状态、病理组织学分级、ER、HER-2、标准化疗、放射治疗对浸润性乳腺癌患者的死亡均无明显影响，见表3。

表3 浸润性乳腺癌死亡的单因素Cox比例风险回归模型分析Tab.3 Univariate Cox proportional hazard regression model analysis of invasive breast cancer for death

将表3中初步筛选出的因子（协变量）统一引入多因素Cox比例风险回归模型分析，结果显示TNM分期是浸润性乳腺癌影响死亡的独立危险预后因素（P=0.001，RR=3.179），PR状态是浸润性乳腺癌影响死亡的独立保护预后因素（P=0.060，RR= 0.529）。

3 讨论

SPARC蛋白是一种高度保守的细胞外间质蛋白，它的主要功能为破坏细胞黏附、调节细胞分化、阻止细胞播散、抑制细胞对某些生长因子的反应、调节胞外基质和基质金属蛋白酶的产生以及影响新生血管生成［7］。本研究显示：SPARC蛋白主要在乳腺癌组织的胞质和间质中表达，阳性表达率为76.1%。SPARC蛋白在肿瘤间质中高表达，可能通过影响肿瘤细胞微环境促进肿瘤细胞生长、侵袭及转移。已有研究证明：SPARC蛋白与浸润性导管癌的间质重塑、CD34及α-SMA表达缺失明显相关，并干扰TGFβ1信号系统，在肿瘤进展中发挥作用［8］。

本研究显示：ER阴性组SPARC蛋白阳性表达率明显高于ER阳性组，2组比较差异有统计学意义（P=0.040）。Graham等［10］曾报道SPARC mRNA表达水平与ER表达水平之间，有明显的统计学负相关性（P=0.009 5），认为ER抑制SPARC基因表达，从而减少受体阳性肿瘤的侵袭性，推测ER表达缺失可能导致SPARC蛋白过表达，与细胞低分化、更具侵袭性有关。本研究首次在蛋白水平发现SPARC蛋白与ER表达之间的关系，从而证明：ER阴性乳腺癌预后差可能与SPARC蛋白过表达有关。Helleman等［11］研究认为：转移性乳腺癌中含SPARC蛋白的细胞外基质基因簇与一线他莫西芬治疗抵抗相关。我们的研究未发现SPARC的表达与内分泌治疗疗效的关系。SPARC蛋白的表达与内分泌治疗耐药之间的关系尚需进一步研究。

关于SPARC蛋白与乳腺癌预后关系的研究目前尚有争论。有研究认为乳腺癌上皮细胞中SPARC蛋白表达增加与生存率降低有关［12～14］；也有报道内源性SPARC蛋白通过降低细胞侵袭活性及肿瘤血管内血小板聚集阻止MDA-MB-231乳腺癌细胞转移，SPARC蛋白上调可能改善乳腺癌预后［15～17］。Kim等［18］评价了253例乳腺浸润性导管癌术后肿瘤组织中SPARC蛋白的表达，未得出SPARC蛋白对浸润性乳腺癌有预测价值的结论。本研究应用Kaplan-Meier生存分析显示SPARC蛋白阳性患者与SPARC蛋白阴性患者的DFS及OS无统计学差别（P＞0.05）。在诊断时未绝经的乳腺癌患者中，SPARC蛋白阳性组的DFS明显劣于SPARC蛋白阴性组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。但在OS分析中无统计学差别。考虑未绝经患者多为年轻女性，是否SPARC蛋白在年轻患者中表达增高预示着预后更差，本研究尚未得出具有统计学意义的结果。可能随着样本量的增加及随访时间延长，会出现有意义的结果。

多因素Cox比例风险回归分析显示SPARC不是浸润性乳腺癌复发及死亡的独立预后因素。TNM分期是复发及死亡的独立危险因素。PR是死亡的独立保护因素。提示TNM分期越晚，预后越差，临床可能需要多种治疗手段结合，尤其对激素受体阳性的患者应用内分泌治疗，都可能起到良好的效果。

本研究纳入255例患者，例数较少，TNMⅠ～Ⅱ期占74.9%，病理组织学分级1级～2级占60.8%，由于样本多为早期患者，复发及死亡事件数量较少，因此在复发及生存分析中未得出具有统计学意义的结果。

总之，本研究显示SPARC蛋白在人体乳腺癌组织的胞质和间质中高表达，与激素受体表达密切相关，SPARC蛋白表达可能是绝经前乳腺癌生存的重要预后指标，未来需进一步探索SPARC蛋白的表达调控及其分子机制与乳腺癌的关系，临床研究进一步扩大样本量为乳腺癌的预后研究提供依据。

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（编辑 武玉欣）

Expression and ClinicalSignificance of SPARCProtein in Breast Cancer

XUDong-xu，XULu，LIYan-jun，LIZhao-hui，LIZhi，TENGYue-e
（DepartmentofOncology，The FirstHospital，China MedicalUniversity，Shenyang 110001，China）

ObjectiveTo study the expression of secreted protein acidic and rich in cysteine（SPARC）in breast cancer，and explore its clinical significance.MethodsA total of 255 tumor specimens of radical operation for breast cancer were collected in the First Hospital of China Medical University from 1997 to 2008.The expression of SPARC protein in breast cancer tissues was detected by tissue chips and immunohistochemical，and its relationship with clinicopathological factors was analyzed.ResultsThe expression rate of SPARC was 76.1%in breast cancer tissues.The positive expression of SPARC protein was related to invasive ductal carcinoma（P=0.007），hormone receptor state（P=0.034），and ER state（P= 0.040）.There was no significant difference of the disease-free survival（DFS）（P=0.451）or overall survival（OS）（P=0.562）between breast cancer patients with/without SPARC expression.Subgroup analysis showed that premenopausal DFS is significantly better than that of SPARC positive patients with SPARC negative group DFS（P=0.013）.Multivariate Cox proportionalhazard regression analysisshowed thatSPARCisnotrecurrence and mortality of independent prognostic factors invasive breast cancer.ConclusionSPARC protein played an important role in the genesis and development of breast cancer，and was closely related with the expression of estrogen receptor，which could be an important index in premenopausalbreastcancerprognosis.

breast cancer；secreted protein acidic and rich in cysteine protein；immunohistochemistry；prognosis

R737.9

A

0258-4646（2014）06-0493-06

国家自然科学基金（81172535）；辽宁省科学技术计划（2010225032）；辽宁省教育厅高校科研计划（L2010698）

徐东旭（1984-），女，医师，硕士研究生.

滕月娥，E-mail：tengyuee0517@163.com.cn

2014-04-04

网络出版时间：