戊巴比妥钠在2型糖尿病大鼠模型复制中的应用研究

刘 华，刘行海，冯 乾，张 婷，买文丽，兰海涛，郑 倩，刘 红

(川北医学院生理学教研室，四川 南充 637100)

中国是世界上糖尿病患者最多的国家，目前患病人数已经超过9 200万[1]，每年全球有大约300多万人死于糖尿病，有600多万人成为新的糖尿病患者[2]。所以，对糖尿病的研究任务仍然紧迫而艰巨。因为糖尿病模型对糖尿病的基础研究具有重要的实用价值，因此近年来成为该领域的研究热点。

目前，国内外广泛使用“高脂饲养+小剂量链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)”的方法诱导糖尿病大鼠模型[3-4]。在长期实验中，我们发现这种造模方法仍然存在一些明显的缺陷，主要体现在：(1)造模成功率不高，一般只能达到50%左右；(2)动物模型稳定性差，2～4周后部分模型自愈转阴，部分模型由于血糖持续升高而死亡；(3)复制的同批次模型大鼠个体间血糖值差异性较大；(4)如果采用STZ连续3～5 d注射，虽然可以提高成模率，但是远期动物死亡率和批量复制费用也会显著增加[5-6]。本实验通过在动物一次性注射小剂量STZ前给予戊巴比妥钠预处理，使全部动物在STZ作用的有效期内都处于相似的机能状态，从而尽量避免上述缺陷和提高糖尿病模型质量。

1 材料与方法

1.1 动物与试剂

雄性Wistar大鼠50只，清洁级，重量180～200 g。动物及饲料均由川北医学院医学实验动物中心提供。STZ与戊巴比妥钠均为Sigma公司产品，胆固醇与猪胆酸盐购自南京生化制药厂，血糖测定仪为长沙三诺科技公司产品。高脂饲料配方：常规饲料65%，12%猪油，20%蔗糖，2.5%胆固醇，0.5%猪胆酸盐。

1.2 动物模型建立与分组

全部实验大鼠分为三组：正常对照组(N组)，n=10；模型复制对照组(C组)，n=20；实验观察组(T组)，n=20。N组全程常规饲料喂养，腹腔注射时用等量柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液作为对照处理；C组高能饲料饲养4周后，禁食12 h，一次性腹腔注射STZ 30 mg/kg(STZ临时用0.1 mol/L，pH=4.2的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液配成0.3%的终浓度)，继续高能饲料饲养4周；T组用1%戊巴比妥钠40 mg/kg腹腔注射麻醉后再给予STZ，其余处理同C组。在STZ注射后第2、4、6、8周末采尾静脉血测定空腹血糖(fasting blood glucose,FBG)和体重，以FBG>7.8 mmol·L-1作为T2DM模型的判断标准[7-8]。在STZ注射后第8周末，断髓处死动物，迅速摘取每组动物胰腺组织和肝脏组织放入10%甲醛溶液中固定后用于常规病理切片并行HE染色。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 STZ注射后各组大鼠FBG和体重的变化

C组大鼠和T组大鼠在STZ注射后血糖逐渐升高，注射4周后，两组大鼠体重呈现逐渐下降趋势。C组动物病情呈分化状态，部分动物血糖逐渐下降，恢复正常，部分动物病情持续加重，甚至死亡。与C组比较，T组大鼠血糖在STZ注射后第2、4、6、8周均有统计学差异(P<0.01)，STZ注射后第8周实验观察组大鼠体重有统计学差异(P<0.01)，其余各时期比较体重无统计学差异(P>0.05)。结果见表1。

表1 STZ注射后各组大鼠血糖和体重的变化

*P<0.01，与C组相应时间点比较。

2.2 STZ注射后各组大鼠各时期成模率和死亡率比较

由表2可见，各时期比较：T组大鼠成模率均显著高于C组(P<0.01)，而死亡率显著低于C组(P<0.01)。第4周两组大鼠成模率均最高。与C组比较，第6、8周T组大鼠死亡率有统计学差异(P<0.01)。T组动物实验全程均无死亡。

表2 STZ注射后各组大鼠成模率和死亡率比较

*P<0.01，与相应对照组比较；#P<0.01，与4周C组比较；△P<0.01，与6周C组比较。

2.3 实验大鼠胰腺、肝脏组织病理学改变

实验复制的2型糖尿病模型大鼠，胰腺组织病理切片观察，镜下胰岛少见，形态不规则，边缘不整齐，胰岛中内分泌细胞数量明显减少，细胞界限不清，个别胰岛内呈空泡样改变(图1，T组取材)。肝细胞疏松，脂肪样变性及灶性坏死，汇管区及肝窦可见炎细胞浸润，肝索排列紊乱，肝窦变窄(图2，T组取材)。

3 讨论

创建一种经济适用、稳定性好、重复率高、远期死亡率低的糖尿病造模方法对糖尿病研究具有重大而现实的意义[9-10]。近年来，国内外对糖尿病动物模型的研究十分活跃，使用高脂诱导动物产生胰岛素抵抗，再用小剂量STZ选择性损伤大鼠部分胰岛B细胞，使胰岛素合成相对减少的造模方法被广泛采用[11-12]。但是，这种造模方法在STZ的用量与用法上，动物成模率与稳定性等方面各研究者的报道差别很大。2008年刘亚平等[13]报道，STZ 30 mg/kg，3周后再次注射30 mg/kg；2009年王玉忠等[14]报道，STZ 30 mg/(kg·d)，连续3 d注射；2011年申彦菊等[15]报道，STZ 30 mg/(kg·d)，连续5 d注射；2011年王嘉惠等[16]报道，STZ 45 mg/kg；2012年薛红丽等[17]报道，STZ 35 mg/kg。在STZ单次用量上，从15 mg/kg至45 mg/kg均有报道，一次模型复制总用量从15 mg/kg至150 mg/kg均有报道，成模率报道从50%至80%不等。

实验中C组大鼠采用我们以往的2型糖尿病复制方法[18]，T组大鼠采用高脂+戊巴比妥钠+STZ的方法复制。实验结果表明，T组大鼠在STZ注射后第2周开始血糖平均水平就显著高于C组大鼠，成模率也比C组大鼠高15%，提示该方法可能缩短成模周期。两组大鼠都在STZ注射后第4周成模率达到高峰，但T组大鼠成模率高达90%，显著高于C组的60%。STZ注射4周后C组大鼠成模率明显下降，部分大鼠由于血糖水平太高，造成糖尿病酮症酸中毒死亡，部分大鼠血糖水平发生自然恢复，而T组大鼠成模率无明显下降，说明在模型稳定性方面，T组大鼠要高于C组大鼠。从结果中的表1看，C组大鼠血糖平均水平的标准差明显高于T组大鼠，说明T组大鼠组内血糖差异度要小于C组大鼠。对T组实验大鼠胰岛与肝脏组织进行病理学观察，低倍镜下胰岛分布少见，形态与边缘改变，高倍镜下岛内细胞数量下降，个别甚至呈空泡样改变；肝细胞疏松，脂肪样变性，汇管区及肝窦炎性病变。这些病理变化也与糖尿病病理吻合，进一步证明了模型的可靠性。

从上述结果分析，“高脂饮食+戊巴比妥钠+小剂量STZ”的2型糖尿病造模方法，与目前研究者广泛采用的“高脂饮食+小剂量STZ”的造模方法比较，相对优势为：大幅提高了造模成功率，降低了造模成本，缩小糖尿病模型个体之间的病理差异，提高模型的稳定性，降低后期转阴率和死亡率，使模型更接近于人类糖尿病的病生病理。戊巴比妥钠在新的造模方法中可能具有以下一些作用：(1)改变了给药方法，由单一给药改为联合给药，通过协同效应增强药物的作用效果，降低了STZ用量；(2)统一给药后状态，由活动状态给药改为麻醉状态给药，统一了STZ作用时的动物机能状态，缩小了模型之间的病理差异；(3)降低了STZ作用时动物的机能，延缓了STZ的代谢，从而增加了STZ的有效作用时间。

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