斑马鱼用于病原菌感染与免疫及自噬的研究进展

李金玲,吴淑燕,黄瑞

苏州大学基础医学与生物科学学院病原生物学系,苏州 215123

斑马鱼(zebrafish)属辐鳍亚纲(Actinopterygii)鲤科(Cyprinidae)短担尼鱼属(Danio)。原产于印度东部和尼泊尔等地，因其体侧有5对延伸至尾部的暗蓝或银色水平条纹而得名。成鱼体长3～5 cm，寿命2～3年[1]。斑马鱼因其体型短小、世代间隔短、产卵量大、体外发育和胚胎透明等优点，作为胚胎发育模型已有100多年的历史。20世纪70年代，其基因潜能被美国俄冈勒大学的George Streisinger发现并利用[2]，成为探索新基因功能、疾病、新药研发、生物钟、自噬与凋亡的一种重要模式生物。鱼类是目前已知的最早具有获得性免疫系统的生物，斑马鱼已具有较低级的获得性免疫系统，与哺乳动物具有一定的相似性[3]，这种特殊的进化地位使其成为了解天然免疫系统和获得性免疫系统进化与功能相互关系的重要工具。

自噬是一种维持机体稳态平衡的过程，能降解胞质内不需要的成分，包括功能缺损的、错误折叠的长寿命大分子物质及受损的细胞器等，在动植物生命活动中发挥着重要作用[4,5]。自噬包括3种类型：巨自噬、微自噬和分子伴侣介导的自噬，其中研究最广泛的是巨自噬。巨自噬在进化上非常保守，通过形成一个双层膜的自噬体结构，将要被降解的物质包裹并在一系列自噬相关基因(autophagy-associated gene，ATG)产物的作用下，与溶酶体融合形成自噬溶酶体，最终在其酸性环境及水解酶作用下降解物质[6]。自噬水平的异常会导致许多疾病的发生，如肿瘤、糖尿病、新陈代谢紊乱、神经退行性疾病、扩张性心肌症、感染等[7]。自噬原指细胞对自身物质的降解，随着研究的逐渐深入，人们发现它在免疫系统与病原菌相互作用中也发挥作用[8]。

自噬已迅速发展成为一个新的免疫范例，它与天然免疫的关系极为密切。两者的联系主要通过对病原菌的应答、损伤相关分子模式﹝如高迁移率族蛋白B1(high mobility group box-1 protein，HMGB1)和白细胞介素1b(interleukin 1b，IL-1b)﹞、Toll样受体(Toll-like receptor，TLR)、核苷酸结合寡聚化结构域样受体、RIG-I样受体等，自噬在炎症反应中的作用同样是由炎症小体介导的。自噬受体(sequestosome 1/p62-like receptor，SLR)本身是一种新类别模式识别受体，它通过直接捕获细菌、生成并运送抗菌肽，作为炎性信号平台促进自噬的发生，进而清除入侵的微生物[9]。p62是一种衔接蛋白，能协助募集Lc3至入侵的细菌周围。同时p62还是SLR中的一员，在自噬和天然免疫中均发挥着重要作用。斑马鱼因其在天然免疫和自噬研究中的优势，对进一步研究两者的联系具有不可忽略的作用。

1 斑马鱼用于病原菌感染与免疫的研究

斑马鱼是一种可有效研究宿主与病原菌相互作用的模式生物，在研究感染性疾病及其引起的免疫应答中发挥着重要作用。近年来体内成像技术与基因分析技术的结合使斑马鱼的应用前景更广阔。斑马鱼通体透明，繁殖周期短，易于操作，使短期内活体观察标记细菌在斑马鱼体内生长和繁殖状况及动态检测自噬对细菌的清除成为可能[10-12]。

作为一种脊椎动物模式生物，斑马鱼在进化上比果蝇和线虫更接近人类，免疫系统发育更完善。在受精后最初的4 d，斑马鱼仅发育出天然免疫系统。发育3周后T细胞和B细胞的功能开始活跃，4～6周后获得性免疫系统完全成熟[2]。因此，可在斑马鱼发育的早期阶段研究天然免疫作用，避免获得性免疫的干扰[13]。

1.1 病原菌感染斑马鱼

目前，人们已成功构建多种病原菌感染斑马鱼模型。Neely等发现人类病原菌如酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes，S.pyogenes)与鱼类病原菌如海豚链球菌(Streptococcusiniae，S.iniae)对斑马鱼的感染率一致，说明链球菌-斑马鱼模型可用于研究人类致病菌[14]。O′Toole 等用绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)标记的鳗弧菌(Vibrioanguillarum，V.anguillarum)浸染斑马鱼，清晰观察到幼鱼的感染过程并发现感染首先发生在胃肠道[12]。

Ordas等对沙门菌感染斑马鱼模型进行深度测序，研究被感染胚胎的天然免疫反应。用数字化基因表达谱测序技术Tag-Seq及转录组测序技术RNA-Seq证实，感染后的斑马鱼胚胎中存在感染应答基因。此类基因不仅包含已知的人类免疫相关基因的同源物，还包括未被证实与免疫有关的新基因，而这2种基因的表达与胚胎是否发育出完整的获得性免疫系统无关[15]。在海分枝杆菌(Mycobacteriummarinum，M.marinum)感染成年斑马鱼模型中，深度测序分析也发现了同样的感染应答基因[16]，这对进一步用斑马鱼研究宿主与病原菌之间的相互作用提供了非常有价值的理论依据。

斑马鱼感染模型中，感染位点、时间及感染菌量都是重要的影响因素。Li等将金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，S.aureus)注射到斑马鱼的眼睛、心包腔、尾静脉、第4后脑心室、卵黄囊和居维管等位点，建立了多位点感染模型。发现卵黄囊、居维管和尾静脉感染模型中斑马鱼发生了全身性感染，受精后36 h内居维管是更合适的感染位点。第4后脑心室感染模型中，斑马鱼发生了温和的抗菌作用。将同剂量的金黄色葡萄球菌通过不同位点注射到斑马鱼体内，经心包腔位点注射的斑马鱼会产生更强的抗菌作用。斑马鱼多位点感染模型可更好地研究病原菌毒力因子与免疫应答之间的作用机制[3]。

1.2 斑马鱼的天然免疫反应

天然免疫系统是宿主抵御病原菌入侵的第1道防线，它的主要功能是尽早识别入侵的病原菌并引发相应的促炎症反应。巨噬细胞和中性粒细胞在哺乳动物的天然免疫系统中必不可少，在斑马鱼中同样重要。在病原菌感染斑马鱼模型中，中性粒细胞和巨噬细胞应答、吞噬细菌的能力具有病原菌特异性[17]。原始的中性粒细胞和巨噬细胞均能吞噬铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa，P.aeruginosa)，但该菌感染斑马鱼的过程主要受中性粒细胞控制[18]。尽管李斯特菌(Listeriamonocytogenes，L.monocytogenes)、鼠伤寒沙门菌(Salmonellatyphimurium，S.typhimurium)和大肠埃希菌(Escherichiacoli，E.coli)感染斑马鱼后中性粒细胞和巨噬细胞均被募集到细菌聚集区，两者相比发现原始的巨噬细胞发挥着更关键的噬菌作用[17]。将金黄色葡萄球菌感染用不同荧光分别标记巨噬细胞和中性粒细胞的斑马鱼，延时成像技术研究发现，中性粒细胞仅在感染早期吞噬细菌，巨噬细胞是发挥吞噬作用的主要免疫细胞[3]。Medina等将GFP标记的沙门菌注射至斑马鱼体内,荧光显微镜实时监测发现，4 h后大部分细菌被巨噬细胞吞噬，感染18 h后可将斑马鱼体内分离出的巨噬细胞进行原代培养，并在荧光显微镜下观察体内被细菌感染的细胞的命运[19]。

Harvie等将野生型海豚链球菌注射到斑马鱼听泡中，发现中性粒细胞和巨噬细胞会吞噬并控制细菌感染。如果破坏中性粒细胞但保持巨噬细胞的功能，其对野生型海豚链球菌更敏感，但对类荚膜突变株(cpsA突变株)的敏感性不变，说明中性粒细胞在控制野生型海豚链球菌感染的过程中发挥重要作用，但在抵御cpsA突变株感染的过程中作用不明显[17]。Colucci-Guyon等将大肠埃希菌注射到斑马鱼充满体液的封闭腔如听泡内，发现中性粒细胞不能有效吞噬细菌；但当细菌黏附到斑马鱼体表时，中性粒细胞有很强的噬菌作用[20]。证实中性粒细胞在充满液体的腔体内能否有效吞噬细菌可能依赖于特定类型的微生物。目前，已成功构建了多种荧光标记巨噬细胞和中性粒细胞的斑马鱼品系，可方便、有效地研究这些免疫细胞在细菌感染与免疫中的作用。

天然免疫的识别过程主要是通过宿主的模式识别受体(pattern recognition receptor，PRR)识别保守的病原体相关分子模式(pathogen-associated molecular pattern，PAMP)。目前研究最透彻的PRR是TLR，表达TLR的细胞主要是抗原呈递细胞，包括巨噬细胞、树突细胞、B细胞等[12]。在斑马鱼中已发现24种TLR组分，其中2种具有鱼类特异性，10种与哺乳动物的TLR基因同源，4种受体蛋白﹝髓样分化因子88(myeloid differentiation factor 88，MyD88)、Ticam1、Mal和Sarm﹞被发现且部分已克隆[12]。作为一种受体分子， MyD88是TLR信号通路和天然免疫系统的核心。van der Vaart等证实MyD88在海分枝杆菌感染斑马鱼幼体后引起的天然免疫应答中起非常重要的作用。myd88缺陷的斑马鱼更易被迟钝爱德华菌(Edwardsiellatarda，E.tarda)、鼠伤寒沙门菌和海分枝杆菌感染。微阵列和定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)分析基因表达揭示，天然免疫的核心转录因子﹝核因子κB(nuclear factor κB，NF-κB)、活化蛋白1(activator protein 1，AP-1)﹞和促炎症基因(il1b和mmp9)的表达在细菌感染时都依赖于MyD88信号通路[21]。TLR相关的信号转导途径无论是在脊椎动物还是在无脊椎动物中都是天然免疫系统的关键通路，细菌感染斑马鱼模型极大促进了TLR途径及天然免疫系统的研究进程。

对斑马鱼免疫系统的研究促进了斑马鱼应用于高通量抗菌药物筛选方面的进步。用斑马鱼进行抗菌药物筛选实验，检测药物致畸率及引起的全身毒性，能提高药物筛选效率及药物的安全性评价，还可弥补细胞药物筛选与啮齿动物药物筛选的缺陷。此外，这种透明的模型还可用于食品药品监督管理局的检测和毒品走私的侦查等[22]。

2 斑马鱼用于自噬的研究

正常情况下，哺乳动物细胞中自噬维持在一定水平，一旦遭受生物逆境如饥饿等刺激就会上调[4]。自噬还可被一些信号所诱导，如氧分压、生长因子、Ca+浓度、神经酰胺、葡萄糖、氨基酸、血清饥饿及微生物入侵等[7]。体外培养的细胞中自噬在抵御病原菌入侵时起非常重要的作用[23]。由于体内影响因素较多，利用斑马鱼研究自噬对病原菌抵御作用的实例并不多。但科学家没有忽视斑马鱼作为自噬研究模型的优势，近年来利用斑马鱼研究自噬获得了许多有价值的结论。

2.1 研究自噬的斑马鱼模型

斑马鱼体内自噬主要有3个作用：清除母体残留物、自身生长发育需要及抵抗外界物质入侵[24]。美国密歇根大学的科学家通过基本局部比对搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool, BLAST)发现，多个自噬相关基因都存在于斑马鱼基因组中，包括ulk1/atg1、atg2～atg5、beclin1/atg6、atg7、lc3/atg8、atg9、atg12、atg16等，表明斑马鱼可作为研究自噬功能和机制的模型[25]。其中微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1A/1B-light chain 3，Lc3)有2种可相互转化的形式：Lc3-Ⅰ和Lc3-Ⅱ。Lc3-Ⅰ主要存在于胞质中，经剪切和泛素化修饰后，与自噬泡膜表面的磷脂酰乙醇胺(phosphatidyl ethanolamine，PE)结合，成为膜结合形式的Lc3-Ⅱ。Lc3-Ⅱ主要存在于前自噬体和自噬体上，是自噬体的标记。Lc3-Ⅱ/Lc3-Ⅰ的比值与自噬体数目呈正相关，在一定程度上反映了自噬水平[26]。

近年来为进一步研究斑马鱼体内自噬，科学家还构建了特异表达GFP-Lc3和GFP-γ-氨基丁酸A受体相关蛋白(GFP-γ-aminobutyric acid type A receptor-associated protein，GFP-Gabarap)的转基因斑马鱼[24,25]。研究发现，从2个细胞的受精卵到受精后24 h的斑马鱼胚胎中能连续检测到高水平的Lc3和Gabarap表达量，而斑马鱼合子基因的表达(开始由母型向合子型过渡)在受精后3 h的囊胚期才开始[27]，说明lc3及gabarapmRNA是母体遗留物。最先发现Lc3-Ⅰ向Lc3-Ⅱ转变是在受精后32 h胚胎中，说明斑马鱼自噬的上调发生在胚胎发育至第2～3天的咽裂期。在受精后48 h的斑马鱼胚胎中同样检测到Lc3-Ⅰ向Lc3-Ⅱ转变，并发现在受精后96 h幼体中Lc3-Ⅱ的表达水平最高。斑马鱼自噬之所以发生较晚，与其他一些自噬相关基因尤其是ulk1和atg9在受精后24 h才开始转录表达有关[24]。从受精后48 h到受精后96 h，斑马鱼体内Lc3-Ⅱ的表达持续增加，证实自噬的诱导发生在此生长发育阶段[24,25]，此时斑马鱼为清除母体残留物自噬水平升高。与哺乳动物相同，斑马鱼自噬水平能被自噬诱导剂西罗莫司(rapamycin，RAPA)或Torin 1上调，也可被自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA)下调，说明其自噬过程依赖于西罗莫司靶蛋白(target of rapamycin，TOR)信号通路[24,25]。用RAPA处理GFP-Lc3斑马鱼胚胎24 h后发现，虽然RAPA能诱导GFP-Lc3点状结构的形成，但这种嵌合型蛋白在溶酶体中很容易降解[10]。用能阻断自噬体与溶酶体融合的氯喹(chloroquine，CQ)处理受精后120 h的GFP-Lc3斑马鱼幼体48 h，发现GFP-Lc3点状结构明显增加，Lc3-Ⅱ/Lc3-Ⅰ比例显著升高[1]。通过进一步量化Lc3与溶酶体的共定位,证实GFP-Lc3点状结构的形成与Lc3-Ⅰ向Lc3-Ⅱ的转变过程是一致的[24,25]。

在斑马鱼成体组织，如肾、心、肝、脾、卵巢、睾丸、肠道和脑中，实时定量PCR均发现了lc3的表达，其中卵巢和肝脏中lc3的表达量相对较高[24]。尽管如此，斑马鱼幼体中雌鱼与雄鱼的自噬水平差异并不明显，这是因为在斑马鱼的发育过程中，性腺的发育是比较特殊的幼鱼雌雄同体现象[28]。早期形成的是没有明显差异的类卵巢结构，真正的性腺分化在23～27日龄。

2.2 斑马鱼的异源自噬

Mostowy等将GFP标记的不同菌量的福氏志贺菌(Shigellaflexneri，S.flexneri)通过静脉注射至受精后72 h的斑马鱼体内，荧光显微镜下观察到感染后20 min大部分细菌被巨噬细胞吞噬，少数被中性粒细胞吞噬。感染后4 h和24 h，致死量和亚致死量感染的幼鱼中巨噬细胞数目均显著降低，而中性粒细胞数目仅在致死量感染的幼鱼中减少，说明中性粒细胞在清除福氏志贺菌的过程中发挥了更重要的作用。此外，中性粒细胞还能吞噬并清除细菌侵染致死的巨噬细胞和非免疫性细胞，发挥“清道夫”的功能[29]。

在巨噬细胞及非免疫性细胞中均发现逃逸至细胞质中的福氏志贺菌，进一步研究发现胞质中的细菌能诱导自噬的发生。用红色荧光标记的细菌感染GFP-lc3转基因斑马鱼4 h后，激光共聚焦显微镜下明显观察到GFP-Lc3聚集到细菌周围；电子显微镜下观察到被自噬体包裹的福氏志贺菌。将斑马鱼p62沉默后，其存活率没有明显变化，细菌感染后其存活率显著降低。细菌计数发现沉默p62的斑马鱼体内细菌数目显著增加，说明p62调控的自噬在控制福氏志贺菌繁殖过程中的作用非常关键。研究微生物入侵斑马鱼后引起的异源自噬机制需构建多种细菌或病毒的感染模型，以利于在该领域进行全面深入的研究[29]。

2.3 斑马鱼模型在自噬相关疾病中的应用

目前，斑马鱼模型被用于许多自噬相关疾病的研究。在心肌症斑马鱼成体模型中发现，注射可引起心肌症的多柔比星(阿霉素，doxorubicin，DOX)3 d后，检测到斑马鱼心脏中自噬水平显著提高，这可能是机体对DOX不适作出的反应；进一步用RAPA处理后发现自噬水平更高，但斑马鱼的死亡数目也明显增多。注射DOX后12 d斑马鱼开始出现心肌症症状时，自噬水平反而降低，此时再用RAPA处理，其心脏功能及成活率均有所提高，说明自噬有保护心脏的功能。以上结果表明，在斑马鱼自噬信号通路中，如果能在不同阶段调控自噬水平便有可能保护心脏，这也为心肌症的治疗提供了一个新的思路[30]。

许多自噬相关基因与肿瘤的发生密切相关，如beclin1缺失会导致人类前列腺癌、卵巢癌及乳腺癌，而atg5和atg7缺失主要导致肝癌。自噬基因缺乏引起的其选择性作用底物p62积累也会增加导致肿瘤发生的可能性[31]。鉴于肝癌的发生与饥饿、生长因子缺失、氧分压及一些破坏性刺激有关，而这些因素正是自噬失调的原因，说明自噬与肝癌的关系尤为密切[30]。为进一步研究自噬在肝癌发生中的作用，新加坡科学家培育出一种肝脏特异表达增强绿色荧光蛋白-Lc3(enhanced green fluorescent protein-Lc3，EGFP-Lc3)的斑马鱼，利用这种模型可直接在荧光显微镜下观察斑马鱼肝脏组织中Lc3的点状结构；这种转基因品系还能培育出特殊表达肝脏癌症基因的新品系，为分析肝脏自噬与肝癌的关系提供了重要工具[24]。

Boglev等利用斑马鱼首次证实了核糖体生物合成与自噬的关系。核糖体生物合成是细胞正常生长与分裂的基础，一旦遭到破坏会导致一系列相关疾病，如白血病、淋巴瘤等[32]。在肠道核糖体合成有缺陷的斑马鱼幼体ttis450中发现，其自噬水平比野生型斑马鱼高，且自噬的诱导并不依赖于TOR和p53(对自噬有双向调控作用)[32]。类似于线粒体自噬途径的选择性作用，斑马鱼幼体ttis450自噬的诱导可能依赖于对核糖体更具有针对性的途径。目前，通过抑制核糖体生物合成、翻译起始及延伸途径，从而锁定癌变翻译装置是治疗癌症的一种新方法[33]。利用斑马鱼模型详尽研究在核糖体应力作用下诱导自噬的胞内环境将对抑制癌细胞的肆意生长提供帮助，也为上述治疗方法提供理论和实验依据[32]。

3 结语

斑马鱼独特的遗传学优势及其与人类基因组的高度同源性，使其成为研究人类相关疾病和在活体内进行先导药物筛选的模式动物。作为一种脊椎动物模型，斑马鱼的生物学特殊性使其在病原菌感染与免疫及自噬的研究中越来越受青睐。良好的细菌感染斑马鱼模型的构建能更好地研究病原菌与宿主之间的相互作用及免疫应答机制，实时分析细菌在体内的繁殖及感染过程。斑马鱼模型依赖于TOR信号通路的自噬机制与哺乳动物类似，利用斑马鱼研究自噬的发生过程和机制将有助于深入了解哺乳动物自噬与疾病之间的关系，同时为预防和治疗疾病提供新的思路和对策。

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