凝聚胺法与微柱凝集法检测孕妇IgG血型抗体效价应用比较

潘小良 宋朝晖 梁巧米 王 敏

1.杭州市第一人民医院输血科，浙江杭州310006；2.山东省医学科学院附属医院妇科，山东济南250031

凝聚胺法与微柱凝集法检测孕妇IgG血型抗体效价应用比较

潘小良1宋朝晖1梁巧米1王 敏2

1.杭州市第一人民医院输血科，浙江杭州310006；2.山东省医学科学院附属医院妇科，山东济南250031

目的比较凝聚胺法与微柱凝集法检测孕妇IgG血型抗体效价的效果。方法选择2012年1月～2013年1月杭州市第一人民医院就诊的ABO血型不合的O型孕妇380例为研究对象，分别采用凝聚胺法与微柱凝集法检测IgG抗A（B）效价，比较两种检测方法的效率；分析ABO血型不合孕妇IgG抗A（B）效价与妊娠次数及年龄的关系。结果①在380例ABO血型不合孕妇中，＞1次妊娠孕妇检出IgG抗A（B）效价≥1∶64者所占比例[77.5%（110/142）]多于1次妊娠者[39.5%（94/238）]，差异有高度统计学意义（P＜0.01）；年龄31～40岁孕妇IgG抗A（B）效价≥1∶64者[61.4%（156/254）]多于21～30岁孕妇[38.1%（48/126）]，差异有高度统计学意义（P＜0.01）。②380例血型不合孕妇中，微柱凝集法检测IgG抗A（B）效价≥1∶64者共352例，IgG抗A（B）效价＜1∶64者28例，凝聚胺法检测IgG抗A（B）效价≥1∶64者共302例，＜1∶64者78例，两者比较差异有统计学意义（P＜0.05）。结论微柱凝集法有操作简便、结果准确、敏感性高、易标准化等诸多优点，更具临床应用价值。

新生儿溶血病；凝聚胺法；微柱凝集法；IgG抗A（B）效价

新生儿溶血病（haemolytic disease ofthe newborn， HDN）特指母婴血型不合引起胎儿或者新生儿的免疫性溶血性疾病，其中尤以ABO血型系统不合的最为常见，主要由IgG抗-A及抗-B抗体引起，多发生于O型母亲所生的非O型新生儿[1]。孕妇IgG抗A（B）效价测定是HDN产前诊断有效手段，在HDN诊治中发挥着重要作用。为了探寻更具临床价值的检测方法，笔者对较新的微柱凝集法与常用的凝聚胺法进行了比较分析。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2012年1月～2013年1月杭州市第一人民医院就诊的夫妇血型不合的O型孕妇380例为研究对象，丈夫为A型者测IgG抗-A，丈夫B型的测IgG抗-B，丈夫AB型的同时测IgG抗-A和抗-B。孕龄24～40周；孕妇年龄21～40岁。采用凝聚胺法再次测定抗体效价，为避免RH系统的干扰，所选孕妇均为RHD阳性，且不规则抗体筛检阴性。

其中按照ABO血型检测系统，入选孕妇中首次妊娠者共计238例，既往有妊娠史包括流产史者共142例；按照孕妇年龄分为21～30岁组（126例）和＞30～40岁组（254例）。

1.2 仪器

BASO血库专用离心机；DiaMed（达亚美）凝胶卡专用孵育器和离心机。

1.3 试剂

0.01 mol/L二硫苏糖醇（DTT）：取0.77 g DTT溶于500 mL生理盐水；DiaMed公司的2号稀释液和Liss/Coombs凝胶卡；0.8%及5%的A型和B型红细胞悬液用献血员血液自制；上海血液生物医药公司的抗A抗B定型试剂、IgM抗D试剂、筛选细胞；珠海BASO公司凝聚胺试剂盒。

1.4 方法

1.4.1 微柱凝集法孕妇血清200μL+0.01 mol/L的DTT溶液200μL，混匀后置37℃孵育30 min，以破坏IgM类抗体。另取洁净试管8支，编号1～8，第1管加达亚美2号稀释液300μL，其余7管各加稀释液200μL。取孵育后血清100μL加于第1管，混匀，取出200μL加入第2管，依次倍比稀释，第8管取出200μL弃去。这样1～8管的稀释度分别是1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256、1∶512、1∶1024。取出达亚美Liss/Coombs卡，做好标记，各孔加入0.8%的A型（或B型）红细胞悬液50μL，再分别加1～8号管中不同稀释比的液体25μL。将加好样的凝胶卡置于专用孵育器内，37℃孵育15 min。将孵育好的凝胶卡置于专用离心机，1000 r/min离心10 min。判读结果：1～8管的IgG抗-A（抗-B）效价分别为8、16、32、64、128、256、512和1024。

1.4.2 凝聚胺法取洁净小试管10支，编号1～10，第1管加0.01 mol/L的DTT溶液100μL及孕妇血清100μL，混匀后37℃孵育30 min。其余9管各加等渗盐水100μL。从孵育后第1管吸取100μL加入第2管混匀，吸取100μL加入第3管，依次做倍比稀释，第10管取100μL弃去。各管分别加5%A型（或B型）红细胞悬液1滴，混匀，各加低离子液（LIM）0.65 mL，混匀，各加凝聚胺（Polybrene）溶液2滴，混匀后3400 r/min离心10 s。倒去上清液，但不能沥干，管底约需残留0.1 mL液体。轻轻摇动，观察红细胞是否凝集，若不凝集则实验失败。最后滴加悬浮液（resuspending）2滴，轻摇试管，观察凝集是否散开，肉眼为不凝者需镜检核实。以最高稀释度凝集管确定抗体效价，1～10管分别是2、4、8、16、32、64、128、256、512、1024。

1.4.3 血型鉴定ABO血型鉴定、RHD血型及不规则抗体筛检根据操作规程[2]。

2 结果

2.1 孕妇血清IgG-A或IgG-B抗体效价测定

在380例ABO血型不合孕妇中，＞1次妊娠孕妇检出IgG抗A（B）效价≥1∶64者比例[77.5%（110/ 142）]多于1次妊娠者[39.5%（94/238）]，差异有高度统计学意义（P＜0.01）；年龄＞30～40岁孕妇IgG抗A（B）效价≥1：64者[61.4%（156/254）]多于21～30岁孕妇[38.1%（48/126）]，差异有高度统计学意义（χ2=9.24，P＜0.01）。见表1。

表1 ABO血型不合孕妇IgG-A或IgG-B抗体效价与妊娠次数及年龄的关系[n（%）]

2.2 两种检测方法在IgG抗A（B）效价中的效率比较

380例血型不合孕妇中，微柱凝集法检测IgG抗A（B）效价≥1∶64者共352例，IgG抗A（B）效价＜1∶64者28例，凝聚胺法检测IgG抗A（B）效价≥1∶64者共302例，＜1∶64者78例，两者≥1∶64者所占比例比较，差异有统计学意义（χ2=4.87，P＜0.05）。见表2。

表2 两种检测方法在IgG抗A（B）效价中的效率比较[n（%）]

3 讨论

HDN起源于胎儿从父亲方继承了母亲方所没有的红细胞抗原，这些抗原可能受到来自母血的免疫抗体的攻击，因为母体的IgG类抗体可以自由通过胎盘屏障，使胎儿红细胞遭受破坏，出现黄疸、水肿、肝脾肿大、贫血，甚至死胎、新生儿死亡等溶血症状。在所有抗体中，只有IgG类抗体能够通过胎盘，因此只有IgG才可能引发HDN。造成ABO血型系统HDN的抗体主要是IgG抗-A和IgG抗-B，这些抗体常常无需经过明显的免疫刺激就可“天然”存在于一些O型人体内，所以O型孕妇第一胎就可能发生HDN，这有别于Rh系统的HDN[3]。IgG抗-A（B）的浓度（效价）是影响ABO HDN严重程度的重要因素，一般认为抗体效价≥64才可能造成HDN，所以，当母体抗体效价≥64时，发生HDN的可能性就较高了。当然，HDN的严重程度还受新生儿ABO抗原的强弱、不同IgG亚类和胎盘功能等因素影响[4]。

凝聚胺（polymatching）法首先利用低离子介质降低溶液的离子强度，减少红细胞周围的阳离子云，促进血清中的抗体与红细胞相应抗原结合，再加入带正电荷的高价阳离子多聚物一凝聚胺，中和红细胞表面存在的大量负电荷，缩短细胞间距，形成可逆的非特异性聚集，并使IgG型抗体能直接凝集红细胞。加入中和液后，仅由凝聚胺引起的非特异性聚集，会因电荷中和而分散，而由抗体介导的特异性凝集则不会散开[5]。本试验是红细胞膜抗原与抗体在凝胶介质中发生的凝集反应，通过具有分子筛作用的凝胶颗粒构成的胶体介质，使游离红细胞和聚集红细胞得以分离。手工凝聚胺可用于不完全抗体的测定与鉴定及交叉配血。本法的特点是：灵敏度比抗球蛋白法高1～20倍，速度快，准确度高于酶试验[6]。微柱凝集作为一项免疫学检测新技术，是凝胶过滤技术和抗原抗体反应的结合，在欧美等发达国家已作为常规性检测技术应用于临床[7]，由于凝胶颗粒具有分子筛作用，抗原抗体反应后的红细胞通过离心经过微柱，无IgG结合的红细胞穿过凝胶到达底部，而红细胞上若有IgG抗体结合则会被凝胶中的抗IgG拉住，红细胞被阻止在凝胶柱上层或中间。本法有操作简便、结果准确、敏感性高、标本量少、易标准化等诸多优点[6]。具体表现为：①简便。操作如同试管法及玻片法一样简单、方便，样本不需要经过洗涤，对阴性结果不需要确证实验，适用于大量标本检测，解决了抗球蛋白试验因程序复杂耗时较长而未能在临床常规应用的问题。多份检测标本一次离心即出结果，有利于临床大量标本应用，单份标本多项指标一次离心出结果，简化了实验程序。②准确。结果清晰明确，可重复性强，将凝集结果从传统的显微镜下平面识别模式转换至卡式立体肉眼判断，避免因经验不足对结果判断的影响。③敏感。微柱凝集法对临床不完全抗体的检测敏感性恰到好处，假阳性和假阴性率均低。④结果保存时间长。室温条件下，试验结果即标本原始反应格局一般可保存数日至数周。其结果还可以拍照存档，数据可以永久保存，并可以远程传输，甚至允许远程多方会诊。⑤标本用量少。其标本量仅为传统试管法的1/10～1/5，尤其有利于新生儿及某些特殊血液病标本的检测。⑥标准化。微柱凝集卡、检测试剂、专用离心机、判读仪及工作程序和结果判定均易于规范化、标准化。⑦安全。整个操作过程能够最大限度减少接触血液标本及病原微生物的机会，减少医源性感染。但是，微柱凝集技术也有其局限性，由于需严格按照试剂盒操作规程操作，使得工作人员的依赖性增大，不利于专业技术的积累和提高。微柱凝集检测系统是商业化产品，因此其成本较传统的血清学试验（如凝聚胺技术）高出许多。微柱凝集抗人蛋白试验及微柱凝胶免疫检测技术的本质是血凝试验，这在理论上为制备抗原抗体包被的红细胞为指示红细胞，以间接血凝试验来检测红细胞抗原抗体以外的其他血液细胞、肿瘤标志物、病原微生物，以及机体其他可溶性抗原抗体，如对药物抗体、自身抗体等的检测都提供了比传统血凝试验更加敏感、准确、简便的方法。所以说微柱凝集技术必将在临床医学各个领域有更为广阔的发展。

尽管凝聚胺法与微柱凝集法都是检测不完全抗体的敏感方法，但本次比对发现，在应用于IgG抗体效价方面，微柱凝集法的敏感度远高于凝聚胺法，绝大多数标本的结果相差1～2个量级，差异程度远高于其他研究结果[8-11]。本研究结果中，妊娠次数＞1次的孕妇其产生IgG抗A（B）效价≥1∶64的比例高于仅有1次妊娠者，且＞30～40岁间的孕产妇其出现IgG抗A（B）效价≥1∶64者比例高于21～30岁者，说明高龄及有多次妊娠的产妇其出现ABO-HDN的概率较高，临床上应尤其对符合上述特点的孕妇定期进行IgG抗A（B）效价检查，对IgG抗A（B）效价≥1∶64者及时采取相应预防及治疗手段。未发现两种方法的结果差异性在检测不同抗体（抗-A与抗-B）中有所不同。快速准确测定IgG抗体效价，能在预测ABO HDN的发生及疾病程度上为临床提供有效的信息。临床上通常以效价64作为有可能发生HDN的临界指标，更为敏感的微柱凝集法能够更早发现孕妇IgG抗体的异常，可尽早医学干预，因而也具有更大的临床价值。鉴于传统的凝聚胺法与微柱凝集法灵敏度的较大差异，测定的结果不具直接可比性，建议实验室建立两种方法各自不同的参考值。

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Comparison of the application of polybrene method and micro-column agglutination assay in the detecting of IgG blood antibody of pregnant women

PAN Xiaoliang1SONG Chaohui1LIANG Qiaomi1WANG Min2
1.Department of Blood Transfusion,the First People's Hospital of Hangzhou City,Zhejiang Province,Hangzhou 310006,China;2.Department of Gynaecology,Affiliated Hospital of Shandong Academy of Medical Sciences,Shandong Province,Ji′nan 250031,China

ObjectiveTo compare the effect of polybrene method and micro-column agglutination assay in detecting of pregnant women maternal IgG blood antibody.Methods380 O blood type pregnant women with ABO blood type incompatibility in the First People's Hospital of Hangzhou City from January 2012 to January 2013 were selected as study objects.Polybrene method and micro-column agglutination assay were used to detect the titer of IgG blood antibody, the efficiency of the two methods was compared.The relationship of IgG-A and IgG-B blood antibody titer and number of pregnancies,age in O blood type pregnant woman of ABO blood type incompatibility was analyzed.Results①The percentage of IgG-A,IgG-B blood antibody titer≥1∶64 in pregnant woman with＞1 time of pregnancy[77.5%(110/142)] was more than that in pregnant woman with 1 time of pregnancy[39.5%(94/238)],the differences were statistically significant(P＜0.05).The percentage of IgG-A,IgG-B blood antibody titer≥1∶64 in pregnant woman of 31-40 years old[61.4%(156/254)]was more than that in pregnant woman of 21-30 years old[38.1%(48/126)],the differences were statistically significant(P＜0.05).②352 cases of IgG blood antibody titer≥1∶64 and 28 cases of IgG blood antibody titer＜1∶64 were found by the method of polybrene,302 cases of IgG blood antibody titer≥1∶64 and 78 cases of IgG blood antibody titer＜1∶64 were found by the method of micro-column agglutination,the differences were statistically significant(P＜0.05).ConclusionMicro-column agglutination method has the advantage of easy operation,consequence accuracy,high sensibility,and has more clinical application value.

Haemolytic disease of the newborn;Polybrene;Micro-column agglutination;IgG-A and IgG-B blood antibody titer

R446

A

1673-7210（2014）03（b）-0085-04

2013-11-12本文编辑：任念）

山东省医药卫生科技发展计划项目（编号2011AS10363）。

潘小良（1967.4-），男，副主任技师；研究方向：医学检验、临床输血、新生儿溶血。