环氧合酶-2和核因子-κB在脓毒症大鼠肝损伤中的表达

李 斌 刘丽平 郭 鸿 李 汛

兰州大学第一医院重症医学科，甘肃兰州730000

环氧合酶-2和核因子-κB在脓毒症大鼠肝损伤中的表达

李 斌 刘丽平 郭 鸿 李 汛

兰州大学第一医院重症医学科，甘肃兰州730000

目的探讨环氧合酶2（COX-2）和核因子-κB（NF-κB）在脓毒症大鼠的肝组织炎性反应中的表达及其相互关系。方法随机选择54只200～220 g成年Wistar大鼠分为3组，假手术A组（实验开始前2 h腹腔内注射生理盐水，麻醉后行开腹手术，不做模型诱导，n=6）；脓毒症模型B组[实验开始前2 h腹腔内注射生理盐水，麻醉后盲肠结扎穿孔（cecal ligation and puncture，CLP）建立腹腔感染模型，n=24]；NS398干预C组（CLP建立腹腔感染模型，实验开始前2 h腹腔内注射NS398 10 mg/kg，n=24）。以CLP法建立动物模型，逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）法检测COX-2 mRNA在肝脏组织的表达，免疫组织化学法（Elisa）测定NF-κB在肝细胞中表达，并检测肝脏功能，如谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）和肝脏大体标本及病理变化。结果①COX-2 mRNA在A组呈低表达（1040.82±2.77），各时点C组较B组明显降低。②肝细胞中NF-κB在A组表达较低[3 h：（0.60±0.54），6 h：（0.60±0.54），12 h：（0.60±0.54），24 h：（0.60±0.54）]，脓毒症后其表达明显增高[3 h：（2.60±0.55），6 h：（7.20± 1.09），12 h：（12.20±0.32），24 h：（6.40±0.73）]；在同一时点比较，B组低于C组[3 h：（1.60±1.89），6 h：（6.60±0.79），12 h：（9.20±2.68），24 h：（4.80±1.60）]（P<0.05）。③Pearson相关分析，COX-2 mRNA与NF-κB呈直线正相关（r= 0.685，P=0.042）。④脓毒症后肝脏转氨酶明显增高[ALT：3 h：（174.00±18.73）U/L，6 h：（204.67±23.59）U/L，12 h：（311.00±44.53）U/L，24 h：（506.67±24.79）U/L；AST：3 h：（619.67±145.81）U/L，6 h：（594.00±34.59）U/L，12 h：（1027.66±136.21）U/L，24 h：（1518.33±139.38）U/L]，NS-398干预后降低[ALT：3 h：（105.33±18.01）U/L，6 h：（157.00±32.36）U/L，12 h：（101.00±16.52）U/L，24 h：（93.33±10.41）U/L；AST：3 h：（217.00±26.21）U/L，6 h：（461.33± 22.01）U/L，12 h：（322.00±72.33）U/L，24 h：（268.00±98.57）U/L]，C组与B组差异有统计学意义（P<0.05），提示经干预肝脏病理损伤减轻。结论COX-2在脓毒症后引起的肝损伤中占有重要地位，NS-398通过特异性抑制COX-2来抑制肝细胞中NF-κB的表达，从而减轻肝细胞损伤。

脓毒症；COX-2；NS398；肝损伤；NF-κB

脓毒症（sepsis）是ICU最为常见的疾病，常常继发于严重创伤、烧伤、休克、大手术后，而脓毒性休克、多器官功能障碍综合征（MODS）等是其进一步发展而来的，已成为当今外科ICU首要死亡原因[1-2]，而肝脏是最常受累的器官之一。核因子-κB（NF-κB）是炎症和免疫应答中的关键因素，能够在基因水平调控一些致炎症细胞因子和诱生型酶，如环氧合酶2（cyclooxygenase-2，COX-2）、一氧化氮合酶（iNOS）等的表达[1-3]。COX-2一般在正常组织较少表达，它主要表达在一些与炎症有密切关系的细胞或组织上，在炎症因子和（或）细胞因子等的刺激下大量表达，参与和加重炎性反应，且其表达水平与炎症的严重程度相关[4-6]。国内外对于NF-κB和COX-2在脓毒症后肝损伤中的作用及相互关系报道不多，所以本研究试图通过建立脓毒症后肝组织炎性反应模型，研究二者在其中的表达和相互关系，探索保护肝细胞的新方法。

1 材料与方法

1.1 实验分组和给药方法

体重200～220 g Wistar雄性大鼠54只（购于兰州大学动物实验中心），称重后随机分为3组：假手术A组（实验开始前2 h腹腔内注射生理盐水，麻醉后行开腹手术，不做模型诱导，n=6）；脓毒症模型B组（实验开始前2 h腹腔内注射生理盐水，麻醉后CLP建立腹腔感染模型，n=24）；NS398干预C组（CLP建立腹腔感染模型，实验开始前2 h腹腔内注射NS398 10 mg/kg，n=24）。将B、C两组根据取材时间不同又分为4组，每组6只。除干预措施不同外，其余喂养相同，分别于造模后3、6、12、24 h，假手术组在术后6 h抽取大鼠门静脉血标本，用于检测肝功能，包括谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）；取肝组织观察病理学改变、免疫组织化学染色和RT-PCR。

1.2 动物模型的建立

盲肠结扎穿孔（cecalligation and puncture，CLP）腹腔感染模型建立参照Flammand等[7]的方法。实验前动物禁食12 h，自由饮水，腹腔内注射1%氯胺酮10 mL/kg，麻醉成功后，无菌操作，腹正中2 cm切口进腹，于盲肠出口处用4号线结扎，18G套管针将盲肠贯通穿孔一次，穿孔为两个，挤出少量肠内容物，还纳肠管于腹腔，间断缝合腹壁。术后各组动物均自由进食饮水。

1.3 主要药物和试剂

NS398购于Sigma公司，NF-κB p65免疫组化试剂盒、SABC试剂盒购于武汉博士德公司，Trizol柱式RNA抽提试剂盒、AMV cDNA第一链合成试剂盒为上海生工公司产品，2×HotStart Taq PCR Mastermix试剂盒为北京天为时代公司产品。

1.4 检测指标和方法

1.4.1 逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）观察COX-2 mRNA水平变化①取-80℃冰箱保存肝组织50μg，用Trizol柱式总RNA抽提试剂盒提取总RNA，并检测纯度和完整性。②RT-PCR（二步法，按照说明书操作）：引物序列（5′→3′）：COX-2上游引物CTG TAT CCC GCC CTG CTG GT；下游引物GAG GCA CTT GCG TTG ATG GT[8]；产物287 bp。β-actin（内参照）上游引物GAT GGT GGG TAT GGG TCA GAA；下游引物CTA GGA GCC AGG GCA GTA ATC；产物839 bp（均由上海生工公司合成）。反应条件：94℃预变性3 min，然后按94℃30 s，50℃30 s，72℃1 min进行28个循环，最后72℃延伸10 min。PCR产物6μL，在1.8%琼脂糖胶上电泳，EB染色，凝胶成像仪照相记录。分析结果以COX-2与相应β-actin条带灰度（IOD）之比值Q表示（Q=IODCOX-2/IODβ-actin），用Quantity One 4.0图像分析软件分析IOD。

1.4.2 肝细胞NF-κB表达的测定采用Elisa法（免疫组织化学法）肝组织标本经10%福尔马林固定，石蜡包埋，4μm切片，分别做HE和NF-κB免疫组化标记，采用SABC法，按试剂盒说明书进行。经DAB显色后，苏木精复染，中性树胶封固。用已知的阳性片作为阳性对照，每组均用PBS代替一抗作阴性对照。所有切片均在同一条件下的显微镜下观察，结果以胞质或胞核中发现棕黄色颗粒或褐色颗粒为阳性细胞，阴性对照则无棕黄色反应产物。取光学显微镜下每平方毫米视野（20×或40×）中的阳性细胞数，随机选择5个视野，其中每平方毫米内的平均阳性细胞数作为计数标准。采用以下评分标准[9]。染色强度分为4级：0级：阴性，1级：弱阳性染色，2级：中度阳性，3级：强阳性染色。每张切片按所见阳性细胞范围分为5级：0级：阴性，1级：1%≤阳性细胞≤25%，2级：25%＜阳性细胞≤50%，3级：50%＜阳性细胞≤75%，4级：75%＜阳性细胞≤100%，每张切片的染色积分以两者之和表示。

1.4.3 肝功能检测用日立7020全自动生化分析仪检测肝功能指标ALT、AST。

1.4.4 超微结构观察TEM-1230透射电镜观察肝脏超微结构改变。

1.5 统计学方法

所得实验数据均由SPSS 13.0软件分析，实验数据满足方差齐性时，采用均数±标准差（x±s）描述，多组比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA）方法，组间两两比较采用Bonfferoni法。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RT-PCR观察COX-2在不同组、不同时间变化结果

由图像软件分析相应条带后可知：肝组织中COX-2 mRNA在假手术组呈低表达（1040.82±2.77）；CLP造模后3 h表达明显增强（2064.04±6.78），到6 h达到高峰（3992.45±16.75），12、24 h仍呈高表达[（2916.80±6.79），（2237.80±7.42）]。NS398干预后各时点COX-2 mRNA表达较脓毒症组显著降低，但是仍然高于假手术组。见图1。

图1 COX-2在不同组、不同时间变化结果

2.2 大体及病理检查结果

2.2.1 假手术组肉眼观察，肝脏无明显改变。肝脏红润，无血性腹水及坏死灶。

2.2.2 脓毒症组各时间点大鼠剖检均可见不同程度的血性腹水，肠管扩张，并可见散布于盲肠、大网膜、肠系膜等处出血、坏死灶和皂化斑。肝脏大小无明显改变，颜色呈暗红色，表面可见散在的点状淤血。电镜下3 h组可见肝细胞核基本正常，Diss间隙增宽，溶酶体增多，线粒体扩张（图2）。6 h组可见肝细胞核固缩、畸形，内质网减少，线粒体嵴断裂、髓鞘样改变，并有肥大细胞、巨噬细胞和浆细胞浸润（图3）。12 h组和24 h组可见细胞变形，血窦扩张，肝细胞核固缩、染色质呈块状、核膜不清，线粒体、内质网明显减少，内质网扩张、脱颗粒，胆小管闭塞、绒毛消失（图4、5）。

2.2.3 NS398干预组除3 h组外，其余各组可见少量血性腹水，肠管轻度扩张，盲肠处可见出血坏死，无灶化斑。肝脏色泽稍暗，未见出血点。电镜下3 h组与脓毒症3h组变化基本相同（图6）。6 h组Diss间隙增宽，核染色质边集，内质网减少，线粒体扩张，未见细胞浸润（图7）。12 h和24 h组可见溶酶体增多，内质网和线粒体仅见个别扩张，个别核膜不完整、染色质边集（图8、9）。

图2 脓毒症组3 h（12 000×）

图3 脓毒症组6 h（25 000×）

图4 脓毒症组12 h（20 000×）

图5 脓毒症组24 h（20 000×）

图6 NS398干预3 h组（15 000×）

图7 NS398干预6 h组（2 0000×）

图8 NS398干预12 h组（12 000×）

图9 NS398干预24 h组（12000×）

2.3实验大鼠在同一时间段ALT、AST变化

结果显示，CLP造模后脓毒症组ALT、AST含量显著增高，到24 h含量最高，各时段与假手术组比较差异有统计学意义（P<0.05）。而NS398干预组ALT、AST含量也增高，在3、12、24 h，与假手术组差异无统计学意义（P>0.05）；相同时段比较，ALT、AST与脓毒症组差异有统计学意义（P<0.05）。这与COX-2 mRNA变化基本相同。见表1。

表1 各组ALT、AST变化比较（U/L，x±s）

2.4 在同一时间段大鼠NF-κB变化

肝细胞中NF-κB在假手术组呈低表达；CLP造模后3 h表达增强，到12 h达到高峰，24 h仍呈高表达。NS-398干预后相同时点NF-κB表达较脓毒症组显著降低，但是仍然高于假手术组（P<0.05）。这与COX-2 mRNA变化基本一致，Pearson相关分析，COX-2 mRNA与NF-κB呈正相关（r=0.685，P= 0.042）。见表2。

表2 各组NF-κB变化比较（U/L，x±s）

3 讨论

脓毒症时机体各个重要器官都有可能受到炎症波及，而肝脏是炎性反应最为剧烈和最容易受到损伤的器官之一，内毒素（LPS）通过直接或间接作用造成肝损伤，其中细胞因子、氧自由基等发挥重要作用[10]。肝损伤的就是各种致病因素作用于肝组织，肝细胞在一定程度上出现变性、坏死和功能性变化。作为重要炎症介质，前列腺素在肝损伤中的细胞因子网络中发挥重要作用。COX是合成各种前列腺素（prostaglandins，PGs）的关键限速酶，在肝损伤时，激素、细胞因子、内毒素和促癌剂等诱导COX-2的表达，氧化应激与脂质过氧化的代谢产物也可诱导COX-2表达参与肝损伤[11]。但是COX-2在肝损伤后高表达，究竟是对肝组织的保护性因素还是损伤性因素，其作用机制如何，目前尚不完全清楚，而且一直存在争议。一些实验研究认为，抑制COX-2表达，不仅可以降低血中炎症细胞和其他有害因子水平，减轻脓毒症症状，从而抵御内毒素介导的感染和死亡，降低病情严重程度。其中的机制可能与COX-2抑制剂能阻碍NF-κB的激活有关。

NF-κB由p50和p65两个亚基组成，只有p65在蛋白的C末端含有转录激活区域能直接作用于转录区域而激活转录过程，因此，可通过测定NF-κB亚单位p65反映NF-κB的活性[12]。近年来研究发现COX-2的基因中含有2个NF-κB位点序列：5-GGG ACT TTC C2-3′，分别位于-445/-427和-223/-214处，该位点序列发生定向突变后，几乎完全封闭TNF-α对COX-2启动子连接的报告基因活性的诱导作用[13]。而且有研究表明COX-2抑制剂发挥抗炎和抗增殖作用主要与抑制转录因子NF-κB或AP-1相关[14]。二者的相互关系如何，相互之间的作用机制如何，所以在前人研究的基础上，笔者假设通过反馈调节机制，可以抑制COX-2 mRNA来减弱NF-κB的表达。

本研究采用经典的CLP，制造与临床感染相似的脓毒症动物模型。结果表明脓毒症之后肝组织炎性反应剧烈，肝脏功能迅速变化，转氨酶快速升高，而且病理变化显著，肝细胞出现变性坏死，这提示已造成一定程度的肝损伤。本研究中笔者观察发现，在没有明显脓毒症的假手术组NF-κB表达较低（0.60±0.54），而在脓毒症B组，3 h后NF-κB表达显著增高，12 h时达到高峰（12.20±0.32），24 h仍然高表达。与此同时，脓毒症后早期肝组织COX-2 mRNA表达即增高，24 h时仍呈高表达，这个变化与NF-κB变化相一致。这说明NF-κB参与脓毒症肝损伤过程，而NF-κB的活化促进了COX-2 mRNA的表达，而且COX-2 mRNA的表达增高可能是造成机体损伤的一种有害机制。当使用COX-2特异性抑制剂NS-398干预后，COX-2 mRNA表达明显降低，肝功能及肝细胞病理损伤明显好转，同时段NF-κB较脓毒症组降低（P<0.05）。Pearson相关分析，COX-2 mRNA与NF-κB呈正相关（r=0.685，P=0.042）。Strong等[15]的研究结果也表明：NS398通过抑制PGE2和COX-2 mRNA表达，从而明显降低致炎症细胞因子产物水平，提高宿主存活率。这些变化使我们有理由相信，选择性COX-2抑制剂在抑制COX-2 mRNA表达的同时，通过负反馈调节机制，减弱NF-κB的表达，从而改善肝损伤，有效保护肝细胞。

通过实验研究表明，COX-2在脓毒症后引起的肝损伤中占有重要地位，NS-398通过负反馈调节机制，特异性抑制COX-2来抑制肝细胞中NF-κB的表达，从而减轻肝细胞损伤。

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Express of cyclooxygenase-2 and NF-κB for hepatocellular injury in rats with sepsis

LI Bin LIU Liping GUO Hong LI Xun
Intensive Care Units,the First Hospitalof Lanzhou University,Gansu Province,Lanzhou 730000,China

ObjectiveTo study the expression of cyclooxygenase 2 and NF-κB on hepatic inflammatory reaction of rats with sepsis and their interrelation.Methods54 Wistar rats(200-220 g)were randomly divided into 3 groups.A:sham group(with saline injected into intraperitoneal 2 h before the experiment,and operation after anesthesia,no-maked model induced,n=6);B:sepsis model group(with saline injected into intraperitoneal 2 h before the experiment,and to make sepsis model after anesthesia by using CLP,n=24);C:NS-398 intervention group(to make sepsis model by using CLP,NS398 10 mg/kg injected into intraperitoneal 2 h before the experiment,n=24).Animal model was established with cecum ligation perforation(CLP)method.RT-PCR were used to determine COX-2 mRNA expression in liver tissue,NF-κB of hepatocyte was detected by immunohistochemical method.At the same time,ALT,AST and liver pathological changes were detected.Results①The expression of COX-2 mRNA were lower in group A(1040.82±2.77), higher in group B than C at the same time.②The expression of NF-κB were lower in hepatocyte in group A[3 h: (0.60±0.54),6 h:(0.60±0.54),12 h:(0.60±0.54),24 h:(0.60±0.54)],but higher after CLP[3 h:(2.60±0.55),6 h:(7.20± 1.09),12 h:(12.20±0.32),24 h:(6.40±0.73)],but were higher in group B than in group C[3 h:(1.60±1.89),6 h:(6.60± 0.79),12 h:(9.20±2.68),24 h:(4.80±1.60)]at the same time(P<0.05).According to Pearson correlation analysis,it was positive correlation between cyclooxygenase-2 mRNA and NF-κB(r=0.685,P=0.042).③Serum ALTand AST weresignificantly increased in B[ALT:3 h:(174.00±18.73)U/L,6 h:(204.67±23.59)U/L,12 h:(311.00±44.53)U/L,24 h: (506.67±24.79)U/L;AST:3 h:(619.67±145.81)U/L,6 h:(594.00±34.59)U/L,12 h:(1027.66±136.21)U/L,24 h: (1518.33±139.38)U/L]than group C[ALT:3 h:(105.33±18.01)U/L,6 h:(157.00±32.36)U/L,12 h:(101.00±16.52)U/L, 24 h:(93.33±10.41)U/L;AST:3 h:(217.00±26.21)U/L,6 h:(461.33±22.01)U/L,12 h:(322.00±72.33)U/L,24 h:(268.00± 98.57)U/L],but significantly decreased in group C than group B(P<0.05).Those prompted Hepatic pathologic injury extenuate after intervention.ConclusionCOX-2 plays an important role in hepatic injury by sepsis,NS-398 can peculiarly inhibitthe expression of NF-κB by inhibiting COX-2,thus relieves injury of hepatocyte.

Sepsis;Cyclooxygenase-2;NS398;Hepatic injury;NF-κB

R631.3

A

1673-7210（2014）03（b）-0014-05

2013-11-11本文编辑：卫轲）

李斌（1972.9-），男，山西交城人，硕士，副主任医师；研究方向：重症医学。

李汛（1972.12-），男，甘肃成县人，博士研究生，主任医师，教授，主要从事普通外科、重症医学方面的研究。